Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Termofili su mikroorganizmi koji napreduju na visokim temperaturama. Njihovo proučavanje može pružiti vrijedne informacije o tome kako se život prilagođava ekstremnim uvjetima. Međutim, teško je postići visoke temperaturne uslove sa konvencionalnim optičkim mikroskopima. Predloženo je nekoliko domaćih rješenja baziranih na lokalnom otpornom električnom grijanju, ali ne postoji jednostavno komercijalno rješenje. U ovom radu predstavljamo koncept mikroskopskog laserskog grijanja preko vidnog polja mikroskopa kako bi se osigurale visoke temperature za termofilne studije, a da se okruženje korisnika očuva blagim. Mikrorazmjerno zagrijavanje umjerenog laserskog intenziteta može se postići korištenjem supstrata obloženog zlatnim nanočesticama kao biokompatibilnog i efikasnog apsorbera svjetlosti. Raspravljaju se o mogućim efektima konvekcije fluida na mikroskali, zadržavanja ćelija i centrifugalnog termoforetskog kretanja. Metoda je demonstrirana na dvije vrste: (i) Geobacillus stearothermophilus, aktivna termofilna bakterija koja se razmnožava na oko 65°C, za koju smo primijetili da klija, raste i pliva pod mikroskom grijanjem; (ii) Thiobacillus sp., optimalno hipertermofilna arheja. na 80°C. Ovaj rad otvara put za jednostavno i sigurno promatranje termofilnih mikroorganizama korištenjem modernih i pristupačnih mikroskopskih alata.
Tokom milijardi godina, život na Zemlji je evoluirao kako bi se prilagodio širokom spektru uslova okoline koji se ponekad smatraju ekstremnim iz naše ljudske perspektive. Konkretno, neki termofilni mikroorganizmi (bakterije, arheje, gljive) koji se nazivaju termofili napreduju u temperaturnom rasponu od 45°C do 122°C1, 2, 3, 4. Termofili žive u različitim ekosistemima, kao što su duboki morski hidrotermalni izvori, topli izvori ili vulkanska područja. Njihovo istraživanje izazvalo je veliko interesovanje u proteklih nekoliko decenija iz najmanje dva razloga. Prvo, od njih možemo naučiti, na primjer, kako su termofili 5, 6, enzimi 7, 8 i membrane 9 stabilni na tako visokim temperaturama, ili kako termofili mogu izdržati ekstremne nivoe zračenja10. Drugo, oni su osnova za mnoge važne biotehnološke primjene1,11,12 kao što su proizvodnja goriva13,14,15,16, kemijska sinteza (dihidro, alkoholi, metan, aminokiseline, itd.)17, bio rudarstvo18 i termostabilni biokatalizatori7 ,11, 13. Konkretno, trenutno dobro poznata lančana reakcija polimeraze (PCR)19 uključuje enzim (Taq polimerazu) izolovan iz termofilne bakterije Thermus aquaticus, jednog od prvih otkrivenih termofila.
Međutim, proučavanje termofila nije lak zadatak i ne može se improvizovati ni u jednom biološkom laboratoriju. Konkretno, živi termofili se ne mogu promatrati in vitro ni sa jednim standardnim svjetlosnim mikroskopom, čak ni sa komercijalno dostupnim grijaćim komorama, obično ocijenjenim za temperature do 40°C. Od 1990-ih, samo nekoliko istraživačkih grupa posvetilo se uvođenju visokotemperaturnih mikroskopskih sistema (HTM). 1994. Glukh et al. Komora za grijanje/hlađenje je zamišljena na osnovu upotrebe Peltierove ćelije koja kontrolira temperaturu pravokutnih kapilara zatvorenih kako bi se održala anaerobnost 20 . Uređaj se može zagrijati do 100 °C brzinom od 2 °C/s, što omogućava autorima da proučavaju pokretljivost hipertermofilne bakterije Thermotoga maritima21. Godine 1999. Horn et al. Razvijen je vrlo sličan uređaj, koji se još uvijek temelji na korištenju zagrijanih kapilara pogodnih za komercijalnu mikroskopiju za proučavanje diobe/povezivanja stanica. Nakon dugog perioda relativne neaktivnosti, potraga za efikasnim HTM-ovima nastavljena je 2012. godine, posebno u vezi sa serijom radova grupe Wirth koji su koristili uređaj koji su izmislili Horn et al. Prije 15 godina, pokretljivost velikog broja arheja, uključujući hipertermofile, proučavana je na temperaturama do 100°C korištenjem zagrijanih kapilara23,24. Oni su također modificirali originalni mikroskop kako bi postigli brže zagrijavanje (nekoliko minuta umjesto 35 minuta za postizanje zadane temperature) i postigli linearni temperaturni gradijent od više od 2 cm preko medija. Ovaj uređaj za oblikovanje temperaturnog gradijenta (TGFD) korišten je za proučavanje mobilnosti mnogih termofila unutar temperaturnih gradijenata na biološki relevantnim udaljenostima 24, 25 .
Zagrijavanje zatvorenih kapilara nije jedini način promatranja živih termofila. U 2012, Kuwabara et al. Korištene su domaće Pyrex komore za jednokratnu upotrebu zapečaćene ljepilom otpornim na toplinu (Super X2; Cemedine, Japan). Uzorci su postavljeni na komercijalno dostupnu prozirnu grijaću ploču (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan) koja se može zagrijati do 110°C, ali nije izvorno namijenjena za bioimaging. Autori su uočili efikasnu podjelu anaerobnih termofilnih bakterija (Thermosipho globiformans, vrijeme udvostručenja 24 min) na 65°C. Godine 2020. Pulshen et al. Efikasno zagrijavanje komercijalnog metalnog posuđa (AttofluorTM, Thermofisher) demonstrirano je korištenjem dva domaća grijaća elementa: poklopca i pozornice (konfiguracija inspirirana PCR mašinom). Ova povezanost rezultira ujednačenom temperaturom tekućine i sprječava isparavanje i kondenzaciju na dnu poklopca. Upotreba O-prstena izbjegava izmjenu plina sa okolinom. Ovaj HTM, nazvan Sulfoskop, korišten je za snimanje Sulfolobus acidocaldarius na 75°C27.
Prepoznato ograničenje svih ovih sistema bilo je ograničenje na upotrebu zračnih objektiva, pri čemu svako uranjanje u ulje nije pogodno za tako visoke temperature i za snimanje kroz prozirne uzorke debljine >1 mm. Prepoznato ograničenje svih ovih sistema bilo je ograničenje na upotrebu zračnih objektiva, pri čemu svako uranjanje u ulje nije pogodno za tako visoke temperature i za snimanje kroz prozirne uzorke debljine >1 mm. Općepriznati nedostatak svih ovih sistema bio je ograničen na korištenje zračnih objekata, s obzirom na bilo koje udubljenje u ulje koje nije pristupilo za trenutnu visoku temperaturu i za vizualizaciju preko prozračnog oblika debljine > 1 mm. Prepoznati nedostatak svih ovih sistema bilo je ograničenje upotrebe zračnih objektiva, jer bilo kakvo uranjanje u ulje nije bilo pogodno za tako visoke temperature i za vizualizaciju kroz prozirne uzorke debljine > 1 mm.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合蚿不适合蚿不适合远毫米厚的透明样品成像。 Prepoznato ograničenje svih ovih sistema je ograničenje upotrebe ogledala sa vazdušnim uvlačenjem, jer bilo kakvo uranjanje u ulje nije pogodno za snimanje prozirnih uzoraka >1 mm debljine na tako visokim temperaturama. Općepriznati nedostatak svih ovih sistema je ograničeno korištenje zračnih objekata, bilo koje inmersiono uvlačenje u ulje neprikladno za takve visoke temperature i vizualizaciju preko prozračnih oblika debljine >1 mm. Prepoznati nedostatak svih ovih sistema je ograničena upotreba zračnih sočiva, svako uranjanje u ulje je neprikladno za tako visoke temperature i vizualizaciju kroz prozirne uzorke debljine >1 mm.Nedavno su ovo ograničenje ukinuli Charles-Orzag et al. 28, koji je razvio uređaj koji više ne daje toplotu oko sistema od interesa, već unutar samog pokrovnog stakla, prekrivenog tankim prozirnim slojem otpornika od ITO (indijum-kalaj oksid). Poklopac se može zagrijati do 75 °C propuštanjem električne struje kroz prozirni sloj. Međutim, autor također mora zagrijati sočivo do objektiva, ali ne više od 65 °C, kako ga ne bi oštetio.
Ovi radovi pokazuju da razvoj efikasne visokotemperaturne optičke mikroskopije nije široko prihvaćen, često zahtijeva kućnu opremu, a često se postiže po cijenu prostorne rezolucije, što je ozbiljan nedostatak s obzirom na to da termofilni mikroorganizmi nisu veći od nekoliko mikrometri. Smanjena zapremina grejanja je ključ za rešavanje tri inherentna problema HTM-a: loša prostorna rezolucija, visoka termička inercija kada se sistem zagreje i štetno zagrevanje okolnih elemenata (imersiono ulje, objektiv objektiva... ili ruke korisnika) na ekstremnim temperaturama. ).
U ovom radu predstavljamo HTM za promatranje termofila koji se ne temelji na otpornom grijanju. Umjesto toga, postigli smo lokalizirano zagrijavanje unutar ograničenog područja vidnog polja mikroskopa laserskim zračenjem podloge koja apsorbira svjetlost. Distribucija temperature je vizualizirana pomoću kvantitativne fazne mikroskopije (QPM). Efikasnost ove metode pokazuju Geobacillus stearothermophilus, pokretna termofilna bakterija koja se razmnožava na oko 65°C i ima kratko vrijeme udvostručenja (oko 20 minuta), i Sulfolobus shibatae, hipertermofil koji raste optimalno na 80°C (archaea) da ilustrujem. Normalna stopa replikacije i plivanje uočeni su kao funkcija temperature. Ovaj laser HTM (LA-HTM) nije ograničen debljinom pokrovnog stakla ili prirodom objektiva (uranjanje u zrak ili ulje). Ovo omogućava korištenje bilo kojeg objektiva visoke rezolucije na tržištu. Također ne pati od sporog zagrijavanja zbog toplinske inercije (postiže trenutno zagrijavanje na skali od milisekundi) i koristi samo komercijalno dostupne komponente. Jedina nova zabrinutost za sigurnost odnosi se na prisustvo snažnih laserskih zraka (obično do 100 mW) unutar uređaja i možda kroz oči, što zahtijeva zaštitne naočale.
Princip LA-HTM je da koristi laser za lokalno zagrijavanje uzorka unutar vidnog polja mikroskopa (slika 1a). Da biste to učinili, uzorak mora biti upijajući svjetlo. Da bismo koristili razumnu snagu lasera (manje od 100 mW), nismo se oslanjali na apsorpciju svjetlosti tekućim medijem, već smo umjetno povećali apsorpciju uzorka premazivanjem supstrata nanočesticama zlata (slika 1c). Zagrijavanje nanočestica zlata svjetlom je od fundamentalnog značaja za područje termalne plazmonike, s očekivanom primjenom u biomedicini, nanohemiji ili prikupljanju sunčeve svjetlosti29,30,31. U proteklih nekoliko godina koristili smo ovaj LA-HTM u nekoliko studija vezanih za primjenu termalne plazme u fizici, hemiji i biologiji. Glavna poteškoća s ovom metodom je u prikazivanju konačnog temperaturnog profila, budući da je povišena temperatura ograničena na mikrosmjernu regiju unutar uzorka. Pokazali smo da se temperaturno mapiranje može postići pomoću interferometra poprečnog smicanja s četiri talasne dužine, jednostavnog, visoke rezolucije i vrlo osjetljive metode kvantitativne fazne mikroskopije zasnovane na korištenju dvodimenzionalnih difrakcijskih rešetki (također poznatih kao poprečne rešetke) 33,34,35,36. Pouzdanost ove tehnike termičke mikroskopije, zasnovane na mikroskopiji talasnog fronta sa ukrštenim rešetkama (CGM), demonstrirana je u desetak radova objavljenih u protekloj deceniji37,38,39,40,41,42,43.
Šema ugradnje paralelnog laserskog mikroskopa za grijanje, oblikovanje i temperaturu. b Geometrija uzorka koja se sastoji od AttofluorTM komore koja sadrži pokrovno staklo obloženo zlatnim nanočesticama. c Pažljivo pogledajte uzorak (ne u mjerilu). d predstavlja uniformni profil laserskog snopa i (e) simuliranu naknadnu distribuciju temperature na ravni uzorka nanočestica zlata. f je prstenasti profil laserskog snopa pogodan za generiranje ujednačene temperature kao što je prikazano u simulaciji rezultujuće raspodjele temperature prikazane u (g). Skala bar: 30 µm.
Konkretno, nedavno smo postigli zagrevanje ćelija sisara sa LA-HTM i CGM i pratili reakcije ćelijskog toplotnog šoka u rasponu od 37-42°C, demonstrirajući primenljivost ove tehnike na snimanje pojedinačnih živih ćelija. Međutim, primjena LA-HTM u proučavanju mikroorganizama na visokim temperaturama nije jednoznačna, jer zahtijeva veći oprez u odnosu na ćelije sisara: prvo, zagrijavanje dna podloge za desetine stupnjeva (a ne za nekoliko stupnjeva) dovodi do do jakog vertikalnog gradijenta temperature. može stvoriti konvekciju fluida 44 koja, ako nije čvrsto pričvršćena za podlogu, može uzrokovati neželjeno kretanje i miješanje bakterija. Ova konvekcija se može eliminisati smanjenjem debljine sloja tečnosti. U tu svrhu, u svim eksperimentima predstavljenim u nastavku, suspenzije bakterija su stavljene između dva pokrovna stakla debljine približno 15 µm smještena unutar metalne čaše (AttofluorTM, Thermofisher, sl. 1b,c). U principu, konvekcija se može izbjeći ako je debljina tekućine manja od veličine zraka grijaćeg lasera. Drugo, rad u tako ograničenoj geometriji može ugušiti aerobne organizme (vidi sliku S2). Ovaj problem se može izbjeći korištenjem podloge koja je propusna za kisik (ili bilo koji drugi vitalni plin), ostavljanjem zarobljenih mjehurića zraka unutar pokrovnog stakla ili bušenjem rupa u gornjem pokrovnom staklu (vidi sliku S1) 45 . U ovoj studiji odabrali smo potonje rješenje (slike 1b i S1). Konačno, lasersko grijanje ne osigurava ravnomjernu raspodjelu temperature. Čak i pri istom intenzitetu laserskog snopa (slika 1d), raspodjela temperature nije ujednačena, već više liči na Gausovu raspodjelu zbog toplinske difuzije (slika 1e). Kada je cilj uspostaviti precizne temperature u vidnom polju za proučavanje bioloških sistema, neravni profili nisu idealni i mogu dovesti do termoforetskog kretanja bakterija ako se ne prianjaju za supstrat (vidi sl. S3, S4)39. U tu svrhu koristili smo prostorni modulator svjetla (SLM) da oblikujemo infracrveni laserski snop prema obliku prstena (slika 1f) u ravnini uzorka kako bismo postigli savršeno ujednačenu raspodjelu temperature unutar date geometrijske površine, uprkos termalnoj difuziji (slika 1d) 39 , 42, 46. Postavite gornji pokrov preko metalne posude (slika 1b) da biste izbegli isparavanje medijuma i posmatrajte najmanje nekoliko dana. Budući da ovo gornje pokrovno staklo nije zapečaćeno, dodatni medij se može lako dodati u bilo koje vrijeme ako je potrebno.
Da bismo ilustrovali kako LA-HTM radi i demonstrirali njegovu primenljivost u termofilnim istraživanjima, proučavali smo aerobne bakterije Geobacillus stearothermophilus, koje imaju optimalnu temperaturu rasta od oko 60-65°C. Bakterija također ima flagele i sposobnost plivanja, što je još jedan pokazatelj normalne ćelijske aktivnosti.
Uzorci (slika 1b) su prethodno inkubirani na 60°C jedan sat, a zatim stavljeni u LA-HTM držač za uzorke. Ova predinkubacija nije obavezna, ali ipak korisna, iz dva razloga: Prvo, kada se laser uključi, uzrokuje da ćelije odmah rastu i dijele se (pogledajte film M1 u Dodatnim materijalima). Bez prethodne inkubacije, rast bakterija se obično odgađa za oko 40 minuta svaki put kada se nova površina za gledanje zagrije na uzorku. Drugo, predinkubacija od 1 sata je potaknula adheziju bakterija na pokrovno staklo, sprječavajući ćelije da odlutaju iz vidnog polja zbog termoforeze kada je laser bio uključen (pogledajte film M2 u Dodatnim materijalima). Termoforeza je kretanje čestica ili molekula duž temperaturnog gradijenta, obično od toplog do hladnog, a bakterije nisu izuzetak43,47. Ovaj neželjeni efekat se eliminiše na datom području korišćenjem SLM za oblikovanje laserskog snopa i postizanje ravne raspodele temperature.
Na sl. Na slici 2 prikazana je raspodjela temperature izmjerena pomoću CGM-a dobivenog zračenjem staklene podloge obložene nanočesticama zlata prstenastim laserskim snopom (slika 1f). Uočena je ravna raspodjela temperature po cijeloj površini pokrivenoj laserskim snopom. Ova zona je postavljena na 65°C, optimalnu temperaturu rasta. Izvan ovog područja, temperaturna kriva prirodno pada na \(1/r\) (gdje je \(r\) radijalna koordinata).
Temperaturna mapa CGM mjerenja dobivena korištenjem prstenastog laserskog snopa za ozračivanje sloja zlatnih nanočestica kako bi se dobio ravan temperaturni profil preko kružnog područja. b Izoterma temperaturne karte (a). Kontura laserskog snopa je predstavljena sivim tačkastim krugom. Eksperiment je ponovljen dvaput (vidi dodatne materijale, slika S4).
Vijabilnost bakterijskih ćelija je praćena nekoliko sati pomoću LA-HTM. Na sl. 3 prikazuje vremenski interval za četiri slike snimljene iz filma od 3 sata i 20 minuta (Film M3, Dodatne informacije). Uočeno je da se bakterije aktivno razmnožavaju unutar kružnog područja definiranog laserom gdje je temperatura bila optimalna, približavajući se 65°C. Nasuprot tome, rast ćelija je značajno smanjen kada je temperatura pala ispod 50°C tokom 10 s.
Slike optičke dubine bakterija G. stearothermophilus koje rastu nakon laserskog zagrijavanja u različito vrijeme, (a) t = 0 min, (b) 1 h 10 min, (c) 2 h 20 min, (d) 3 h 20 min, od 200 Izvađeno iz jednominutnog filma (M3 film naveden u Dodatnim informacijama) koji je postavljen na odgovarajuću temperaturnu mapu. Laser se uključuje u trenutku \(t=0\). Izoterme su dodate slici intenziteta.
Da bismo dalje kvantifikovali rast ćelija i njegovu zavisnost od temperature, izmerili smo povećanje biomase različitih kolonija prvobitno izolovanih bakterija u vidnom polju Movie M3 (slika 4). Roditeljske bakterije odabrane na početku formiranja jedinice za formiranje mini kolonija (mCFU) prikazane su na slici S6. Mjerenja suhe mase vršena su kamerom CGM 48 koja je korištena za mapiranje distribucije temperature. Sposobnost CGM-a da mjeri suvu težinu i temperaturu je snaga LA-HTM-a. Kao što se i očekivalo, visoka temperatura izazvala je brži rast bakterija (slika 4a). Kao što je prikazano na semi-log dijagramu na slici 4b, rast na svim temperaturama prati eksponencijalni rast, gdje podaci koriste eksponencijalnu funkciju \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), gdje je \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) – vrijeme generiranja (ili vrijeme udvostručavanja), \( g =1/ \tau\) – stopa rasta (broj podjela po jedinici vremena). Na sl. 4c prikazuje odnosnu brzinu rasta i vrijeme generiranja kao funkciju temperature. Brzo rastuće mCFU karakterizira zasićenje rasta nakon dva sata, očekivano ponašanje zbog velike gustine bakterija (slično stacionarnoj fazi u klasičnim tekućim kulturama). Opšti oblik \(g\left(T\right)\) (slika 4c) odgovara očekivanoj dvofaznoj krivulji za G. stearothermophilus sa optimalnom stopom rasta oko 60-65°C. Usporedite podatke pomoću kardinalnog modela (Slika S5)49 gdje je \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, što se dobro slaže sa drugim vrednostima navedenim u literaturi49. Iako su parametri zavisni od temperature ponovljivi, maksimalna stopa rasta \({G}_{0}\) može varirati od jednog eksperimenta do drugog (pogledajte slike S7-S9 i film M4). Za razliku od parametara prilagođavanja temperature, koji bi trebali biti univerzalni, maksimalna brzina rasta ovisi o svojstvima medija (dostupnost hranjivih tvari, koncentracija kisika) unutar posmatrane geometrije mikroskala.
a Rast mikroba na različitim temperaturama. mCFU: minijaturne jedinice za formiranje kolonija. Podaci dobijeni iz videa jedne bakterije koja raste u temperaturnom gradijentu (film M3). b Isto kao (a), polulogaritamska skala. c Brzina rasta\(\tau\) i vrijeme generiranja\(g\) izračunato iz linearne regresije (b). Horizontalne trake greške: temperaturni raspon preko kojeg su se mCFU proširile u vidno polje tokom rasta. Vertikalne trake greške: standardna greška linearne regresije.
Osim normalnog rasta, neke bakterije su ponekad isplivale u vidjelo tokom laserskog grijanja, što je očekivano ponašanje za bakterije sa flagelama. Film M5 u dodatnim informacijama prikazuje takve plivačke aktivnosti. U ovom eksperimentu, ujednačeno lasersko zračenje je korišteno za stvaranje temperaturnog gradijenta, kao što je prikazano na slikama 1d, e i S3. Slika 5 prikazuje dvije sekvence slika odabrane iz filma M5 koje pokazuju da jedna bakterija pokazuje usmjereno kretanje dok sve ostale bakterije ostaju nepomične.
Dva vremenska okvira (a) i (b) prikazuju plivanje dvije različite bakterije označene tačkastim krugovima. Slike su izvučene iz M5 filma (dostavljeno kao dodatni materijal).
U slučaju G. stearothermophilus, aktivno kretanje bakterija (slika 5) počelo je nekoliko sekundi nakon uključivanja laserskog zraka. Ovo zapažanje naglašava vremenski odgovor ovog termofilnog mikroorganizma na povećanje temperature, kao što su već primijetili Mora i sar. 24 . Tema pokretljivosti bakterija, pa čak i termotaksije, može se dalje istražiti pomoću LA-HTM.
Mikrobno plivanje ne treba miješati s drugim vrstama fizičkog kretanja, naime (i) Brownovo kretanje, koje izgleda kao haotično kretanje bez određenog smjera, (ii) konvekcija 50 i termoforeza 43, koja se sastoji u pravilnom kretanju duž temperature gradijent.
G. stearothermophilus je poznat po svojoj sposobnosti da proizvodi vrlo otporne spore (formiranje spora) kada je izložen nepovoljnim uvjetima okoline kao obrana. Kada uslovi životne sredine ponovo postanu povoljni, spore klijaju, formirajući žive ćelije i nastavljaju rast. Iako je ovaj proces sporulacije/klijanja dobro poznat, nikada nije uočen u realnom vremenu. Koristeći LA-HTM, ovdje izvještavamo o prvom zapažanju događaja klijanja kod G. stearothermophilus.
Na sl. 6a prikazuje time-lapse slike optičke dubine (OT) dobijene korištenjem CGM seta od 13 spora. Za cijelo vrijeme sakupljanja (15 h 6 min, \(t=0\) – početak laserskog zagrijavanja), klijalo je 4 od 13 spora, u uzastopnim vremenskim tačkama \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' i \(11\) h \(30\)'. Iako je samo jedan od ovih događaja prikazan na slici 6, 4 događaja klijanja mogu se uočiti u M6 filmu u dodatnom materijalu. Zanimljivo je da je klijanje nasumično: ne klijaju sve spore i ne klijaju u isto vrijeme, uprkos istim promjenama u uvjetima okoline.
a Time-lapse koji se sastoji od 8 OT slika (uranjanje u ulje, 60x, 1,25 NA objektiv) i (b) evolucija biomase agregata G. stearothermophilus. c (b) Nacrtano na polu-logo skali kako bi se istakla linearnost stope rasta (isprekidana linija).
Na sl. 6b,c prikazuje biomasu ćelijskih populacija u vidnom polju kao funkciju vremena tokom čitavog perioda prikupljanja podataka. Brzo raspadanje suve mase uočeno na \(t=5\)h na sl. 6b, c, zbog izlaska nekih ćelija iz vidnog polja. Stopa rasta ova četiri događaja je \(0,77\pm 0,1\) h-1. Ova vrijednost je viša od stope rasta povezana sa slikama 3. 3 i 4, gdje ćelije rastu normalno. Razlog za povećanu stopu rasta G. stearothermophilus iz spora je nejasan, ali ova mjerenja naglašavaju interes LA-HTM-a i rade na nivou jedne ćelije (ili na nivou jedne mCFU) kako bi saznali više o dinamici života ćelije .
Da bismo dalje demonstrirali svestranost LA-HTM-a i njegove performanse na visokim temperaturama, ispitali smo rast Sulfolobus shibatae, hipertermofilne acidofilne arheje s optimalnom temperaturom rasta od 80°C51. U poređenju sa G. stearothermophilus, ove arheje takođe imaju veoma različitu morfologiju, više liče na kuglice od 1 mikrona (koke) nego na izdužene štapiće (bacile).
Slika 7a sastoji se od sekvencijalnih optičkih dubinskih slika S. shibatae mCFU dobijenih korištenjem CGM (pogledajte M7 igrani film u Dodatnim materijalima). Ovaj mCFU raste na oko 73°C, ispod optimalne temperature od 80°C, ali unutar temperaturnog raspona za aktivan rast. Promatrali smo višestruke događaje fisije zbog kojih mCFU nakon nekoliko sati izgledaju kao mikrogrožđe arheje. Iz ovih OT slika, biomasa mCFU je mjerena tokom vremena i predstavljena na slici 7b. Zanimljivo je da su mCFU S. shibatae pokazale linearni rast, a ne eksponencijalni rast viđen kod mCFU G. stearothermophilus. Postojala je dugogodišnja rasprava 52 o prirodi stope rasta ćelija: dok neke studije navode stope rasta mikroba koje su proporcionalne njihovoj veličini (eksponencijalni rast), druge pokazuju konstantnu stopu (linearni ili bilinearni rast). Kako su objasnili Tzur et al.53, razlikovanje između eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva preciznost od <6% u mjerenju biomase, što je nedostižno za većinu QPM tehnika, čak i koje uključuju interferometriju. Kako su objasnili Tzur et al.53, razlikovanje između eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva preciznost od <6% u mjerenju biomase, što je nedostižno za većinu QPM tehnika, čak i koje uključuju interferometriju. Kako su objasnili Cur i dr.53, različita eksponencijalna i (bi)linearna visina zahtijeva preciznost <6% u izmjerenoj biomasi, što je nedovoljno za veće QPM metode, čak i korištenjem interferometrije. Kako su objasnili Zur et al.53, razlikovanje eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva <6% tačnosti u mjerenju biomase, što je nedostižno za većinu QPM metoda, čak i uz korištenje interferometrije.Kako su objasnili Zur et al. 53, razlikovanje između eksponencijalnog i (bi)linearnog rasta zahtijeva manje od 6% tačnosti u mjerenju biomase, što je nedostižno za većinu QPM metoda, čak i kada se koristi interferometrija. CGM postiže ovu tačnost sa sub-pg preciznošću u mjerenju biomase36,48.
a Time-lapse koji se sastoji od 6 OT slika (uranjanje u ulje, 60x, NA cilj 1,25) i (b) evolucija mikro-CFU biomase mjerena CGM-om. Pogledajte film M7 za više informacija.
Savršeno linearan rast S. shibatae bio je neočekivan i još nije prijavljen. Međutim, očekuje se eksponencijalni rast, barem zato što s vremenom mora doći do više podjela od 2, 4, 8, 16 … ćelija. Pretpostavili smo da bi linearni rast mogao biti posljedica inhibicije stanica zbog gustog pakiranja stanica, baš kao što se rast stanica usporava i na kraju dostiže stanje mirovanja kada je gustina stanica previsoka.
Završavamo razmatranjem sljedećih pet zanimljivih tačaka redom: smanjenje volumena grijanja, smanjenje toplinske inercije, interes za nanočestice zlata, interes za kvantitativnu faznu mikroskopiju i mogući temperaturni raspon u kojem se LA-HTM može koristiti.
U poređenju sa otpornim grijanjem, lasersko grijanje koje se koristi za razvoj HTM-a nudi nekoliko prednosti, koje ćemo ilustrirati u ovoj studiji. Konkretno, u tečnim medijima u vidnom polju mikroskopa, zapremina grejanja se održava unutar nekoliko (10 μm) 3 zapremine. Na taj način su aktivni samo posmatrani mikrobi, dok su ostale bakterije u stanju mirovanja i mogu se koristiti za dalje proučavanje uzorka – nema potrebe da se uzorak mijenja svaki put kada je potrebno provjeriti novu temperaturu. Osim toga, mikrozagrijavanje omogućava direktno ispitivanje velikog raspona temperatura: Slika 4c je dobijena iz 3-satnog filma (Movie M3), koji obično zahtijeva pripremu i ispitivanje nekoliko uzoraka – po jedan za svaki od ispitivanih uzoraka. y je temperatura koja predstavlja broj dana u eksperimentu. Smanjenje zagrijanog volumena također održava sve okolne optičke komponente mikroskopa, posebno sočivo objektiva, na sobnoj temperaturi, što je do sada bio veliki problem s kojim se zajednica suočavala. LA-HTM se može koristiti sa bilo kojim objektivom, uključujući leće za uranjanje u ulje, i ostat će na sobnoj temperaturi čak i pri ekstremnim temperaturama u vidnom polju. Glavno ograničenje metode laserskog grijanja koje izvještavamo u ovoj studiji je da ćelije koje ne prianjaju ili plutaju mogu biti daleko od vidnog polja i teško ih je proučavati. Zaobilazno rješenje bi moglo biti korištenje sočiva sa malim uvećanjem za postizanje većeg porasta temperature od nekoliko stotina mikrona. Ovaj oprez je praćen smanjenjem prostorne rezolucije, ali ako je cilj proučavanje kretanja mikroorganizama, visoka prostorna rezolucija nije potrebna.
Vremenska skala za grijanje (i hlađenje) sistema \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}) zavisi od njegove veličine, prema zakonu \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), gdje je \ (L\ ) je karakteristična veličina izvora topline (promjer laserskog snopa u našem istraživanju je \(L\ oko 100\) μm), \(D\) je toplinska difuzivnost okoline (prosjek u našoj kućište, staklo i voda Brzina difuzije\(D\ oko 2\puta {10}^{-7}\) m2/s Prema tome, u ovoj studiji, vremenski odgovori reda 50 ms, tj. kvazi-trenutni). temperaturne promjene, može se očekivati Ovo trenutno uspostavljanje porasta temperature ne samo da skraćuje trajanje eksperimenta, već i omogućava precizno mjerenje vremena \(t=0\) za bilo koje dinamičko proučavanje temperaturnih efekata.
Naša predložena metoda je primjenjiva na bilo koju podlogu koja apsorbira svjetlost (na primjer, komercijalni uzorci sa ITO premazom). Međutim, nanočestice zlata su u stanju da obezbede visoku apsorpciju u infracrvenom i nisku apsorpciju u vidljivom opsegu, čije su poslednje karakteristike od interesa za efikasno optičko posmatranje u vidljivom opsegu, posebno kada se koristi fluorescencija. Osim toga, zlato je biokompatibilno, kemijski inertno, optička gustoća se može podesiti od 530 nm do blizu infracrvene, a priprema uzorka je jednostavna i ekonomična29.
Mikroskopija talasnog fronta sa poprečnim rešetkama (CGM) omogućava ne samo mapiranje temperature na mikroskali, već i praćenje biomase, što je čini posebno korisnim (ako nije neophodno) u kombinaciji sa LA-HTM. Tokom protekle decenije razvijene su i druge tehnike temperaturne mikroskopije, posebno u oblasti bioimaginga, a većina njih zahteva upotrebu fluorescentnih sondi osetljivih na temperaturu54,55. Međutim, ove metode su kritikovane i neki izvještaji su mjerili nerealne promjene temperature unutar ćelija, vjerovatno zbog činjenice da fluorescencija ovisi o mnogim faktorima osim temperature. Osim toga, većina fluorescentnih sondi je nestabilna na visokim temperaturama. Stoga, QPM i posebno CGM predstavljaju idealnu temperaturnu mikroskopsku tehniku za proučavanje života na visokim temperaturama pomoću optičke mikroskopije.
Studije S. shibatae, koje žive optimalno na 80°C, pokazuju da se LA-HTM može primijeniti za proučavanje hipertermofila, a ne samo jednostavnih termofila. U principu, ne postoji ograničenje raspona temperatura koje se mogu postići korištenjem LA-HTM, pa čak i temperature iznad 100°C mogu se postići na atmosferskom tlaku bez ključanja, kao što je pokazala naša grupa od 38 u hidrotermalnim kemijskim primjenama na atmosferskom pritisak A. Laser se koristi za zagrevanje nanočestica zlata 40 na isti način. Dakle, LA-HTM ima potencijal da se koristi za posmatranje hipertermofila bez presedana sa standardnom optičkom mikroskopom visoke rezolucije u standardnim uslovima (tj. pod stresom okoline).
Svi eksperimenti su izvedeni pomoću kućnog mikroskopa, uključujući Köhlerovo osvjetljenje (sa LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), držač uzorka s ručnim xy pomicanjem, objektive (Olympus, 60x, 0,7 NA, zrak, LUCPlanFLN60X ili 60x, NA O O , UPLFLN60XOI), CGM kamera (QLSI unakrsna rešetka, 39 µm korak, 0,87 mm od Andor Zyla senzora kamere) za pružanje slike intenziteta i talasnog fronta, i sCMOS kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bitni način, iz Hamamatsua) za snimanje podaci prikazani na slici 5 (bakterijsko plivanje). Dikroični razdjelnik snopa je 749 nm BrightLine rub (Semrock, FF749-SDi01). Filter na prednjoj strani kamere je 694 kratkopropusni filter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titan safirni laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpana šupljina cunami lasera, Spectra-Physics na sl. 2-5, dalje zamijenjen Millenia laserom, Spectraphysics 10 W, pumpana šupljina Mira lasera, Koherentna, za Sl. -5). 6 i 7) postavljeni su na talasnu dužinu \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, što odgovara plazmonskom rezonantnom spektru nanočestica zlata. Prostorni modulatori svjetlosti (1920 × 1152 piksela) kupljeni su od Meadowlark Optics-a.
Mikroskopija talasnog fronta sa unakrsnom rešetkom (CGM) je tehnika optičke mikroskopije zasnovana na kombinovanju dvodimenzionalne difrakcione rešetke (takođe poznate kao poprečna rešetka) na udaljenosti od jednog milimetra od senzora konvencionalne kamere. Najčešći primjer CGM-a koji smo koristili u ovoj studiji zove se interferometar poprečnog pomaka s četiri talasne dužine (QLSI), gdje se unakrsna rešetka sastoji od uzorka šahovnice intenziteta/faze koji su uveli i patentirali Primot et al. u 200034. Vertikalne i horizontalne linije rešetke stvaraju senke poput mreže na senzoru, čije se izobličenje može numerički obraditi u realnom vremenu kako bi se dobilo optičko izobličenje talasnog fronta (ili ekvivalentni fazni profil) upadne svjetlosti. Kada se koristi na mikroskopu, CGM kamera može prikazati razliku optičke putanje snimljenog objekta, također poznatu kao optička dubina (OT), s osjetljivošću reda nanometara36. U bilo kom CGM mjerenju, da bi se eliminisali bilo kakvi defekti u optičkim komponentama ili snopovima, mora se uzeti primarna referentna OT slika i oduzeti od svih narednih slika.
Temperaturna mikroskopija je izvedena pomoću CGM kamere kako je opisano u referenci. 32. Ukratko, zagrevanje tečnosti menja njen indeks prelamanja, stvarajući termalni efekat sočiva koji iskrivljuje upadni snop. Ovu distorziju talasnog fronta meri CGM i obrađuje pomoću algoritma dekonvolucije da bi se dobila trodimenzionalna raspodela temperature u tečnom mediju. Ako su nanočestice zlata ravnomjerno raspoređene po uzorku, temperaturno mapiranje se može napraviti u područjima bez bakterija kako bi se dobile bolje slike, što ponekad radimo. Referentna CGM slika je snimljena bez zagrijavanja (sa isključenim laserom) i naknadno snimljena na istoj lokaciji na slici s uključenim laserom.
Mjerenje suhe mase se postiže korištenjem iste CGM kamere koja se koristi za snimanje temperature. CGM referentne slike su dobijene brzim pomeranjem uzorka po x i y tokom ekspozicije kao sredstvo za usrednjavanje bilo kakve nehomogenosti u OT zbog prisustva bakterija. Iz OT slika bakterija, njihova biomasa je dobivena korištenjem ansambla slika na područjima odabranim korištenjem Matlabovog domaćeg algoritma segmentacije (vidi pododjeljak “Numerički kod”), slijedeći proceduru opisanu u ref. 48. Ukratko, koristimo relaciju \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), gdje je \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) slika optičke dubine, \(m\) je suha težina i \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) je konstanta. Izabrali smo \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, što je tipična konstanta za žive ćelije.
Poklopac prečnika 25 mm i debljine 150 µm obložen zlatnim nanočesticama stavljen je u AttofluorTM komoru (Thermofisher) sa zlatnim nanočesticama okrenutim prema gore. Geobacillus stearothermophilus je prethodno kultivisan preko noći u LB medijumu (200 rpm, 60°C) pre svakog dana eksperimenata. Kap od 5 µl suspenzije G. stearothermophilus optičke gustoće (OD) od 0,3 do 0,5 stavljena je na pokrivno staklo sa zlatnim nanočesticama. Zatim je na kap ispušteno okruglo pokrivno staklo promjera 18 mm s rupom promjera 5 mm u sredini, a na centar rupe je više puta naneseno 5 μl bakterijske suspenzije iste optičke gustoće. Bunari na pokrovnim stakalcima pripremljeni su u skladu sa postupkom opisanim u ref. 45 (pogledajte Dodatne informacije za više informacija). Zatim dodajte 1 ml LB medijuma u pokrovno staklo kako biste spriječili da se tečni sloj osuši. Posljednji pokrovni stakal se stavlja preko zatvorenog poklopca Attofluor™ komore kako bi se spriječilo isparavanje podloge tokom inkubacije. Za eksperimente klijanja koristili smo spore, koje su, nakon konvencionalnih eksperimenata, ponekad prekrivale gornji pokrovni stakal. Slična metoda je korištena za dobivanje Sulfolobus shibatae. Tri dana (200 rpm, 75°C) preliminarne kultivacije Thiobacillus serrata obavljena su u medijumu 182 (DSMZ).
Uzorci nanočestica zlata pripremljeni su micelarnom blok kopolimerskom litografijom. Ovaj proces je detaljno opisan u Pogl. 60. Ukratko, micele koje inkapsuliraju ione zlata sintetizirane su miješanjem kopolimera sa HAuCl4 u toluenu. Očišćena pokrovna stakla su zatim uronjena u rastvor i tretirana UV zračenjem u prisustvu redukcionog agensa da bi se dobilo zlatno seme. Konačno, sjemenke zlata su uzgajane kontaktom pokrovnog stakla s vodenim rastvorom KAuCl4 i etanolamina u trajanju od 16 minuta, što je rezultiralo kvaziperiodičnim i vrlo ujednačenim rasporedom nesferičnih nanočestica zlata u bliskom infracrvenom području.
Za konvertovanje interferograma u OT slike, koristili smo domaći algoritam, kao što je detaljno opisano na linku. 33 i dostupan je kao Matlab paket u sljedećem javnom spremištu: https://github.com/baffou/CGMprocess. Paket može izračunati intenzitet i OT slike na osnovu snimljenih interferograma (uključujući referentne slike) i udaljenosti niza kamera.
Za izračunavanje faznog uzorka primijenjenog na SLM za dobivanje zadanog temperaturnog profila, koristili smo prethodno razvijeni domaći algoritam39,42 koji je dostupan u sljedećem javnom spremištu: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Ulaz je željeno temperaturno polje, koje se može podesiti digitalno ili putem jednobojne bmp slike.
Za segmentiranje ćelija i mjerenje njihove suhe težine, koristili smo naš Matlab algoritam objavljen u sljedećem javnom spremištu: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. Na svakoj slici korisnik mora kliknuti na bakteriju ili mCFU od interesa, podesiti osjetljivost štapića i potvrditi odabir.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.
Podaci koji podržavaju rezultate ove studije dostupni su od odgovarajućih autora na razuman zahtjev.
Izvorni kod korišten u ovoj studiji je detaljno opisan u odjeljku Metode, a verzije za otklanjanje grešaka mogu se preuzeti sa https://github.com/baffou/ u sljedećim repozitorijumima: SLM_temperatureShaping, CGMprocess i CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Uvid u termofile i njihove primjene širokog spektra. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Uvid u termofile i njihove primjene širokog spektra.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK Pregled termofila i njihova široka primjena. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. i Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. i Sharma AK Duboko razumijevanje termofila i širok spektar primjena.3 Biotehnologija 6, 81 (2016).
Vrijeme objave: Sep-26-2022