Alchajmerovoj bolesti (AD) nedostaju proteinski biomarkeri koji odražavaju njenu višestruku temeljnu patofiziologiju, ometajući napredak dijagnoze i liječenja. Ovdje koristimo sveobuhvatnu proteomiku za identifikaciju biomarkera cerebrospinalne tekućine (CSF) koji predstavljaju širok raspon patofiziologije AD. Multipleksna masena spektrometrija identificirala je približno 3.500 i približno 12.000 proteina u AD CSF i mozgu, respektivno. Mrežna analiza moždanog proteoma razriješila je 44 modula biodiverziteta, od kojih se 15 preklapalo s proteomom cerebrospinalne tekućine. CSF AD markeri u ovim modulima koji se preklapaju su presavijeni u pet proteinskih grupa, koje predstavljaju različite patofiziološke procese. Sinapse i metaboliti u AD mozgu se smanjuju, ali se CSF povećava, dok se glijalna mijelinizacija i imunološke grupe u mozgu i CSF povećavaju. Konzistentnost i specifičnost bolesti kod promjena panela potvrđene su u više od 500 dodatnih uzoraka likvora. Ove grupe su takođe identifikovale biološke podgrupe u asimptomatskoj AD. Sve u svemu, ovi rezultati su obećavajući korak ka web-baziranim biomarker alatima za kliničke primjene u AD.
Alchajmerova bolest (AD) je najčešći uzrok neurodegenerativne demencije širom sveta i karakteriše je širok spektar disfunkcija biološkog sistema, uključujući sinaptički prenos, imunitet posredovan glijama i metabolizam mitohondrija (1-3). Međutim, njegovi utvrđeni proteinski biomarkeri i dalje se fokusiraju na otkrivanje amiloida i tau proteina, te stoga ne mogu odražavati ovu raznoliku patofiziologiju. Ovi "core" proteinski biomarkeri koji se najpouzdanije mjere u cerebrospinalnoj tekućini (CSF) uključuju (i) amiloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42), koji odražava formiranje kortikalnih amiloidnih plakova; (ii) totalni tau, znak degeneracije aksona; (iii) fosfo-tau (p-tau), predstavnik patološke tau hiperfosforilacije (4-7). Iako su ovi biomarkeri cerebrospinalne tekućine uvelike olakšali naše otkrivanje “označenih” proteinskih bolesti AD (4-7), oni predstavljaju samo mali dio kompleksne biologije iza bolesti.
Nedostatak patofiziološke raznolikosti AD biomarkera doveo je do mnogih izazova, uključujući (i) nemogućnost da se identifikuje i kvantificira biološka heterogenost pacijenata s AD, (ii) nedovoljno mjerenje težine i progresije bolesti, posebno u pretkliničkoj fazi, i ( iii) razvoj terapijskih lijekova koji nisu uspjeli u potpunosti riješiti sve aspekte neurološkog pogoršanja. Naše oslanjanje na značajnu patologiju za opis AD od povezanih bolesti samo pogoršava ove probleme. Sve više dokaza pokazuje da većina starijih osoba s demencijom ima više od jedne patološke karakteristike kognitivnog pada (8). Čak 90% ili više osoba sa AD patologijom takođe ima vaskularne bolesti, inkluzije TDP-43 ili druge degenerativne bolesti (9). Ovi visoki udjeli patološkog preklapanja poremetili su naš trenutni dijagnostički okvir za demenciju i potrebna je sveobuhvatnija patofiziološka definicija bolesti.
S obzirom na hitnu potrebu za raznim AD biomarkerima, ovo polje sve više usvaja metodu „omike“ zasnovanu na cjelokupnom sistemu za otkrivanje biomarkera. Alijansa Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD pokrenuta je 2014. godine i na čelu je programa. Ovaj multidisciplinarni napor Nacionalnog instituta za zdravlje, akademske zajednice i industrije ima za cilj korištenje sistemskih strategija za bolje definiranje patofiziologije AD i razvoj dijagnostičke analize biodiverziteta i strategija liječenja (10). Kao dio ovog projekta, mrežna proteomika je postala obećavajući alat za unapređenje sistemskih biomarkera u AD. Ovaj nepristrasni pristup vođen podacima organizira složene skupove podataka o proteomici u grupe ili “module” ko-ekspresiranih proteina koji su povezani sa specifičnim tipovima stanica, organelama i biološkim funkcijama (11-13). Gotovo 12 studija o mrežnoj proteomici bogate informacijama provedeno je na AD mozgu (13-23). Sve u svemu, ove analize pokazuju da proteom AD moždane mreže održava visoko očuvanu modularnu organizaciju u nezavisnim kohortama i višestrukim kortikalnim regijama. Osim toga, neki od ovih modula pokazuju ponovljive promjene u obilju povezanih s AD u nizovima podataka, odražavajući patofiziologiju više bolesti. Zajedno, ovi nalazi pokazuju obećavajuću sidrišnu tačku za otkriće proteoma moždane mreže kao sistemski baziranog biomarkera u AD.
Kako bismo transformirali proteom AD moždane mreže u klinički korisne biomarkere zasnovane na sistemu, kombinirali smo mrežu izvedenu iz mozga s proteomskom analizom AD CSF. Ovaj integrirani pristup doveo je do identifikacije pet obećavajućih skupova biomarkera CSF koji su povezani sa širokim spektrom patofiziologije zasnovane na mozgu, uključujući sinapse, krvne sudove, mijelinizaciju, upalu i disfunkciju metaboličkih puteva. Uspješno smo potvrdili ove panele biomarkera kroz višestruke analize replikacije, uključujući više od 500 uzoraka likvora iz različitih neurodegenerativnih bolesti. Ove validacijske analize uključuju ispitivanje grupnih ciljeva u CSF pacijenata sa asimptomatskom AD (AsymAD) ili pokazivanje dokaza abnormalne akumulacije amiloida u normalnom kognitivnom okruženju. Ove analize naglašavaju značajnu biološku heterogenost u AsymAD populaciji i identifikuju panel markere koji mogu biti u stanju da podtipuju pojedince u najranijim fazama bolesti. Sve u svemu, ovi rezultati predstavljaju ključni korak u razvoju alata za proteinske biomarkere zasnovane na više sistema koji mogu uspješno riješiti mnoge kliničke izazove s kojima se suočava AD.
Glavna svrha ove studije je identificirati nove biomarkere cerebrospinalne tekućine koji odražavaju različite patofiziologije na mozgu koje dovode do AD. Slika S1 prikazuje našu metodologiju istraživanja, koja uključuje (i) sveobuhvatnu analizu vođenu preliminarnim nalazima AD CSF i mrežnog proteoma mozga za identifikaciju više biomarkera bolesti likvora povezanih s mozgom, i (ii) naknadnu replikaciju Ovi biomarkeri se nalaze u nekoliko nezavisnih cerebrospinalnih fluidne kohorte. Istraživanje usmjereno na otkriće započelo je analizom diferencijalne ekspresije CSF-a kod 20 kognitivno normalnih osoba i 20 pacijenata s AD u Emory Goizueta Alchajmerovom centru za istraživanje Alchajmerove bolesti (ADRC). Dijagnoza AD se definiše kao značajno kognitivno oštećenje u prisustvu niskog Aβ1-42 i povišenih nivoa ukupnog tau i p-tau u cerebrospinalnoj tečnosti [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabela S1A). Kontrola (srednja vrednost MoCA, 26,7 ± 2,2) imala je normalne nivoe biomarkera CSF.
Ljudsku likvoru karakterizira dinamički raspon obilja proteina, u kojem albumin i drugi proteini koji imaju veliku količinu mogu spriječiti otkrivanje proteina od interesa (24). Da bismo povećali dubinu otkrića proteina, uklonili smo prvih 14 proteina sa visokim sadržajem iz svakog uzorka CSF prije analize masene spektrometrije (MS) (24). MS je identificirao ukupno 39.805 peptida, koji su mapirani na 3691 proteom u 40 uzoraka. Kvantifikacija proteina se izvodi višestrukim tandem mass tag (TMT) označavanjem (18, 25). Da bismo riješili nedostajuće podatke, u naknadnu analizu smo uključili samo one proteine koji su kvantificirani u najmanje 50% uzoraka, čime smo konačno kvantificirali 2875 proteoma. Zbog značajne razlike u nivoima ukupne količine proteina, kontrolni uzorak je statistički smatran izvanrednim (13) i nije uključen u kasniju analizu. Vrijednosti rasprostranjenosti preostalih 39 uzoraka su prilagođene prema dobi, spolu i kovarijansi serije (13-15, 17, 18, 20, 26).
Koristeći statističku analizu t-testa za procjenu diferencijalne ekspresije na skupu podataka regresije, ova analiza je identificirala proteine čiji su nivoi zastupljenosti značajno promijenjeni (P <0,05) između kontrolnog i AD slučajeva (Tabela S2A). Kao što je prikazano na slici 1A, brojnost od ukupno 225 proteina u AD je značajno smanjena, a brojnost 303 proteina je značajno povećana. Ovi različito eksprimirani proteini uključuju nekoliko prethodno identificiranih AD markera cerebrospinalne tekućine, kao što je protein tau povezan s mikrotubulama (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), protein povezan s rastom 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), protein koji vezuje masne kiseline 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), hitinaza 3 poput 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), neuronski granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) i faktor rasta VGF nerva (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Međutim, identifikovali smo i druge veoma važne ciljeve, kao što su inhibitor GDP disocijacije 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) i modularno vezivanje kalcijuma povezano sa SPARC-om 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Analiza genske ontologije (GO) 225 značajno smanjenih proteina otkrila je blisku povezanost s procesima tjelesnih tekućina kao što su metabolizam steroida, koagulacija krvi i aktivnost hormona (Slika 1B i Tabela S2B). Nasuprot tome, značajno povećani protein 303 usko je povezan sa ćelijskom strukturom i energetskim metabolizmom.
(A) Grafikon vulkana pokazuje log2 puta promjenu (x-osa) u odnosu na -log10 statističku P vrijednost (y-osa) dobivenu t-testom, koji se koristi za otkrivanje diferencijalne ekspresije između kontrolne (CT) i AD slučajevi proteoma CSF Od svih proteina. Proteini sa značajno smanjenim nivoima (P <0,05) u AD prikazani su plavom bojom, dok su proteini sa značajno povišenim nivoima u bolesti prikazani crvenom bojom. Odabrani protein je označen. (B) Glavni GO pojmovi koji se odnose na protein značajno su smanjeni (plavi) i povećani (crveni) u AD. Prikazuje tri GO termina s najvišim z-skorima u poljima bioloških procesa, molekularnih funkcija i ćelijskih komponenti. (C) MS je izmjerio nivo MAPT u uzorku CSF (lijevo) i njegovu korelaciju sa ELISA nivoom tau uzorka (desno). Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije sa relevantnom P vrijednošću. Zbog nedostatka ELISA podataka za jedan slučaj AD, ove brojke uključuju vrijednosti za 38 od 39 analiziranih slučajeva. (D) Nadzirana klaster analiza (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) prilagođen P <0,01) na kontrolnim i AD CSF pronađenim uzorcima koristeći 65 najznačajnije promijenjenih proteina u setu podataka. Standardizovati, normalizovati.
Proteomski nivo MAPT usko je povezan sa nezavisno izmerenim ELISA tau nivoom (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; Slika 1C), što podržava validnost našeg MS merenja. Nakon digestije tripsina na nivou amiloidnog prekursora proteina (APP), peptidi specifični za izoformu mapirani na C-terminus Aβ1-40 i Aβ1-42 ne mogu se efikasno jonizirati (27, 28). Stoga, APP peptidi koje smo identifikovali nemaju nikakve veze sa nivoima ELISA Aβ1-42. Kako bismo procijenili diferencijalnu ekspresiju u svakom slučaju, koristili smo različito eksprimirane proteine s P <0,0001 [stopa lažnog otkrivanja (FDR) ispravljena P <0,01] da bismo izvršili nadgledanu klaster analizu uzoraka (Tabela S2A). Kao što je prikazano na slici 1D, ovih 65 visoko značajnih proteina može ispravno grupirati uzorke prema stanju bolesti, osim u jednom slučaju AD sa karakteristikama sličnim kontroli. Od ovih 65 proteina, 63 su se povećala u AD, dok su se samo dva (CD74 i ISLR) smanjila. Ukupno, ove analize cerebrospinalne tečnosti su identifikovale stotine proteina u AD koji mogu poslužiti kao biomarkeri bolesti.
Zatim smo izvršili nezavisnu mrežnu analizu AD moždanog proteoma. Kohorta mozga ovog otkrića uključivala je dorsolateralni prefrontalni korteks (DLPFC) iz kontrolne (n = 10), Parkinsonovu bolest (PD; n = 10), mješoviti AD/PD (n = 10) i AD (n = 10) slučajeva. ) Uzorak. Emery Goizueta ADRC. Demografija ovih 40 slučajeva je prethodno opisana (25) i sažeta je u tabeli S1B. Koristili smo TMT-MS za analizu ovih 40 moždanih tkiva i replikacijsku kohortu od 27 slučajeva. Ukupno, ova dva skupa podataka o mozgu proizvela su 227.121 jedinstveni peptid, koji su mapirani na 12.943 proteoma (25). Samo oni proteini koji su kvantificirani u najmanje 50% slučajeva uključeni su u naknadna istraživanja. Konačni skup podataka o otkriću sadrži 8817 kvantificiranih proteina. Podesite nivoe obilja proteina na osnovu starosti, pola i postmortem intervala (PMI). Analiza diferencijalne ekspresije skupa podataka nakon regresije pokazala je da je >2000 nivoa proteina značajno promijenjeno [P <0,05, analiza varijanse (ANOVA)] u dvije ili više kohorti bolesti. Zatim smo izvršili nadgledanu klaster analizu zasnovanu na diferencijalno eksprimiranim proteinima i P <0,0001 u AD/kontrolnoj i/ili AD/PD poređenjima (Slika S2, A i B, Tabela S2C). Ovih 165 visoko izmijenjenih proteina jasno oslikavaju slučajeve s AD patologijom iz kontrolnih i PD uzoraka, potvrđujući snažne promjene specifične za AD u cijelom proteomu.
Zatim smo koristili algoritam nazvan Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) da izvršimo analizu mreže na otkrivenom proteomu mozga, koji organizira skup podataka u proteinske module sa sličnim obrascima ekspresije (11-13). Analiza je identifikovala 44 modula (M) koekspresiranih proteina, sortiranih i numerisanih od najvećih (M1, n = 1821 proteina) do najmanjih (M44, n = 34 proteina) (Slika 2A i Tabela S2D)). Kao što je gore spomenuto (13) Izračunajte reprezentativni profil ekspresije ili karakterističan protein svakog modula i povežite ga sa stanjem bolesti i AD patologijom, odnosno uspostavite savez registra Alchajmerove bolesti (CERAD) i Braakovog rezultata (Slika 2B). Ukupno, 17 modula je bilo značajno povezano sa neuropatologijom AD (P <0,05). Mnogi od ovih modula povezanih sa bolestima također su bogati markerima specifičnim za tip ćelije (Slika 2B). Kao što je gore spomenuto (13), obogaćivanje tipa ćelije određuje se analizom preklapanja modula i referentne liste gena specifičnih za tip ćelije. Ovi geni su izvedeni iz objavljenih podataka u izolovanim mišjim neuronima, endotelnim i glijalnim ćelijama. Eksperiment sekvencioniranja RNA (RNA-seq) (29).
(A) Otkrijte WGCNA moždanog proteoma. (B) Dvotežinska srednja korelacija (BiCor) analiza modularnog signaturnog proteina (prva glavna komponenta modularne ekspresije proteina) sa neuropatološkim karakteristikama AD (gore), uključujući CERAD (Aβ plak) i Braak (tau tangles) rezultate. Intenzitet pozitivne (crvene) i negativne (plave) korelacije prikazan je toplotnom mapom u dvije boje, a zvjezdice označavaju statističku značajnost (P <0,05). Koristite Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (donji) za procjenu povezanosti tipa ćelije za svaki proteinski modul. Intenzitet crvenog senčenja označava stepen obogaćivanja ćelijskog tipa, a zvjezdica označava statističku značajnost (P <0,05). Koristite BH metodu da ispravite P vrijednost izvedenu iz FET-a. (C) GO analiza modularnih proteina. Najbliži biološki procesi prikazani su za svaki modul ili srodnu grupu modula. oligo, oligodendrocit.
Skup od pet blisko povezanih modula bogatih astrocitima i mikroglijama (M30, M29, M18, M24 i M5) pokazao je snažnu pozitivnu korelaciju sa neuropatologijom AD (slika 2B). Ontološka analiza povezuje ove glijalne module sa rastom ćelije, proliferacijom i imunitetom (slika 2C i tabela S2E). Dva dodatna glijalna modula, M8 i M22, takođe su snažno pojačana u bolesti. M8 je visoko povezan sa Toll-like receptorskim putem, signalnom kaskadom koja igra ključnu ulogu u urođenom imunološkom odgovoru (30). U isto vrijeme, M22 je usko povezan s posttranslacijskom modifikacijom. M2, koji je bogat oligodendrocitima, pokazuje snažnu pozitivnu korelaciju s AD patologijom i ontološku vezu sa sintezom nukleozida i replikacijom DNK, što ukazuje na pojačanu proliferaciju stanica u bolestima. Sve u svemu, ovi nalazi podržavaju elevaciju glijalnih modula koje smo prethodno uočili u proteomu AD mreže (13, 17). Trenutno je otkriveno da mnogi glijalni moduli povezani sa AD u mreži pokazuju niže nivoe ekspresije u kontrolnim i PD slučajevima, naglašavajući njihovu specifičnost bolesti koja je povišena u AD (Slika S2C).
Samo četiri modula u našem mrežnom proteomu (M1, M3, M10 i M32) imaju jaku negativnu korelaciju s AD patologijom (P <0,05) (Slika 2, B i C). I M1 i M3 su bogati neuronskim markerima. M1 je visoko povezan sa sinaptičkim signalima, dok je M3 usko povezan sa mitohondrijalnom funkcijom. Nema dokaza o obogaćivanju tipa ćelije za M10 i M32. M32 odražava vezu između M3 i ćelijskog metabolizma, dok je M10 u velikoj mjeri povezan s rastom ćelije i funkcijom mikrotubula. U poređenju sa AD, sva četiri modula su povećana u kontroli i PD, dajući im AD promene specifične za bolest (Slika S2C). Sve u svemu, ovi rezultati podržavaju smanjeno obilje modula bogatih neuronima koje smo prethodno uočili u AD (13, 17). Ukratko, mrežna analiza moždanog proteoma koju smo otkrili proizvela je AD-specifično izmijenjene module u skladu s našim prethodnim nalazima.
AD karakterizira rana asimptomatska faza (AsymAD), u kojoj pojedinci pokazuju akumulaciju amiloida bez kliničkog kognitivnog pada (5, 31). Ova asimptomatska faza predstavlja kritičan prozor za rano otkrivanje i intervenciju. Prethodno smo demonstrirali snažno modularno očuvanje proteoma AsymAD i AD moždane mreže u nezavisnim skupovima podataka (13, 17). Kako bismo osigurali da je mreža mozga koju smo trenutno otkrili u skladu s ovim prethodnim nalazima, analizirali smo očuvanje 44 modula u repliciranom skupu podataka iz 27 DLPFC organizacija. Ove organizacije uključuju slučajeve kontrole (n = 10), AsymAD (n = 8) i AD (n = 9). Kontrolni i AD uzorci uključeni su u analizu naše kohorte mozga otkrića (Tabela S1B), dok su slučajevi AsymAD bili jedinstveni samo u kohorti replikacije. Ovi AsymAD slučajevi su također došli iz Emory Goizueta ADRC banke mozga. Iako je kognicija bila normalna u vrijeme smrti, nivoi amiloida su bili abnormalno visoki (prosječni CERAD, 2,8 ± 0,5) (Tabela S1B).
TMT-MS analiza ovih 27 moždanih tkiva rezultirala je kvantifikacijom 11.244 proteoma. Ovo konačno brojanje uključuje samo one proteine kvantificirane u najmanje 50% uzoraka. Ovaj replicirani skup podataka sadrži 8638 (98,0%) od 8817 proteina otkrivenih u našem otkriću analize mozga, i ima skoro 3000 značajno promijenjenih proteina između kontrolne i AD kohorte (P <0,05, nakon Tukeyjevog uparenog t testa za analizu varijanse) ( Tabela S2F). Među ovim različito eksprimiranim proteinima, 910 je također pokazao značajne promjene nivoa između AD i kontrolnih slučajeva proteoma mozga (P <0,05, nakon ANOVA Tukey uparenog t-testa). Vrijedi napomenuti da su ovi markeri 910 vrlo konzistentni u smjeru promjene između proteoma (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (Slika S3A). Među povećanim proteinima, proteini s najdosljednijim promjenama između skupova podataka uglavnom su članovi modula M5 i M18 bogatih glijama (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 i GFAP). Među reduciranim proteinima, oni sa najkonzistentnijim promjenama bili su gotovo isključivo članovi M1 modula (NPTX2, VGF i RPH3A) povezanih sa sinapsom. Dalje smo potvrdili promjene vezane za AD midkine-a (MDK), CD44, izlučenog proteina 1 povezanog s kovrčavim (SFRP1) i VGF-a western blottingom (slika S3B). Analiza očuvanja modula pokazala je da je oko 80% proteinskih modula (34/44) u proteomu mozga značajno očuvano u skupu podataka o replikaciji (z-score> 1,96, FDR ispravljen P <0,05) (Slika S3C). Četrnaest od ovih modula je bilo posebno rezervisano između dva proteoma (z-score> 10, FDR korigovani P <1,0 × 10-23). Sve u svemu, otkriće i replikacija visokog stupnja konzistentnosti u diferencijalnoj ekspresiji i modularnoj kompoziciji između proteoma mozga naglašava reproduktivnost promjena u proteinima frontalnog korteksa AD. Osim toga, također je potvrđeno da AsymAD i naprednije bolesti imaju vrlo sličnu strukturu moždane mreže.
Detaljnija analiza diferencijalne ekspresije u skupu podataka o replikaciji mozga naglašava značajan stepen promjena AsymAD proteina, uključujući ukupno 151 značajno promijenjen protein između AsymAD-a i kontrole (P <0,05) (Slika S3D). U skladu s amiloidnim opterećenjem, APP u mozgu AsymAD-a i AD značajno se povećao. MAPT se značajno mijenja samo u AD, što je u skladu sa povećanim nivoima zapetljanosti i njegovom poznatom korelacijom sa kognitivnim padom (5, 7). Moduli bogati glijama (M5 i M18) se snažno odražavaju na povećane proteine u AsymAD-u, dok je M1 modul vezan za neurone najreprezentativniji od smanjenih proteina u AsymAD-u. Mnogi od ovih AsymAD markera pokazuju veće promjene u simptomatskim bolestima. Među tim markerima je SMOC1, glijalni protein koji pripada M18, a koji je povezan s tumorima mozga i razvojem očiju i udova (32). MDK je faktor rasta koji vezuje heparin povezan sa rastom ćelija i angiogenezom (33), još jedan član M18. U poređenju sa kontrolnom grupom, AsymAD je značajno povećan, praćen većim povećanjem AD. Nasuprot tome, sinaptički protein neuropentraxin 2 (NPTX2) je značajno smanjen u AsymAD mozgu. NPTX2 je ranije bio povezan s neurodegeneracijom i ima prepoznatu ulogu u posredovanju ekscitatornih sinapsi (34). Sve u svemu, ovi rezultati otkrivaju niz različitih pretkliničkih promjena proteina u AD za koje se čini da napreduju s težinom bolesti.
S obzirom da smo u otkriću moždanog proteoma postigli značajnu dubinu pokrivenosti proteinima, pokušavamo potpunije razumjeti njegovo preklapanje s AD transkriptomom na nivou mreže. Stoga smo uporedili proteom mozga koji smo otkrili sa modulom koji smo prethodno generirali mjerenjem mikromreža 18.204 gena u AD (n = 308) i kontrolnim (n = 157) DLPFC tkivima (13). preklapanje. Ukupno smo identifikovali 20 različitih RNK modula, od kojih su mnogi pokazali obogaćivanje specifičnih tipova ćelija, uključujući neurone, oligodendrocite, astrocite i mikrogliju (slika 3A). Višestruke promjene ovih modula u AD prikazane su na slici 3B. U skladu s našom prethodnom analizom preklapanja proteina i RNK korištenjem dublje neobilježenog MS proteoma (oko 3000 proteina) (13), većina od 44 modula u mreži proteoma mozga koje smo pronašli nalazi se u mreži transkriptoma. Nema značajnog preklapanja. Čak iu naše otkriće i replikacija 34 proteinska modula koji su visoko zadržani u proteomu mozga, samo 14 (~40%) je prošlo Fisherov egzaktni test (FET) pokazalo se da ima statistički značajno preklapanje sa transkriptomom (Slika 3A). Kompatibilan sa popravkom oštećenja DNK (P-M25 i P-M19), translacijom proteina (P-M7 i P-M20), vezivanjem/spajanjem RNA (P-M16 i P-M21) i ciljanjem proteina (P-M13 i P- M23) se ne preklapa sa modulima u transkriptomu. Stoga, iako se u trenutnoj analizi preklapanja koristi dublji skup podataka o proteomu (13), većina proteoma AD mreže nije mapirana u mrežu transkriptoma.
(A) Hipergeometrijski FET pokazuje obogaćivanje markera specifičnih za tip ćelije u RNA modulu AD transkriptoma (gore) i stepen preklapanja između RNA (x-osa) i proteina (y-osa) modula AD mozga (dole) . Intenzitet crvenog senčenja ukazuje na stepen obogaćivanja tipova ćelija u gornjem panelu i intenzitet preklapanja modula u donjem panelu. Zvjezdica označava statističku značajnost (P <0,05). (B) Stepen korelacije između karakterističnih gena svakog modula transkriptoma i AD statusa. Moduli na lijevoj strani su u najnegativnijoj korelaciji sa AD (plavi), a oni na desnoj strani su u najpozitivnijoj korelaciji sa AD (crveni). Log-transformirana BH-korigirana P vrijednost ukazuje na stepen statističke značajnosti svake korelacije. (C) Značajno preklapanje modula sa zajedničkim obogaćivanjem tipa ćelije. (D) Analiza korelacije log2 puta promjene označenog proteina (x-osa) i RNK (y-osa) u modulu koji se preklapa. Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije sa relevantnom P vrijednošću. Mikro, mikroglija; nebeska tijela, astrociti. CT, kontrola.
Većina modula proteina i RNK koji se preklapaju dijele slične profile obogaćivanja tipa ćelija i konzistentne smjerove promjene AD (Slika 3, B i C). Drugim riječima, M1 modul moždanog proteoma (PM1) povezan sa sinapsom je mapiran na tri homologna RNK modula bogata neuronima (R-M1, R-M9 i R-M16), koji se nalaze u AD. smanjen nivo. Slično, moduli proteina M5 i M18 bogati glijama preklapaju se sa RNA modulima bogatim astrocitima i mikroglijalnim markerima (R-M3, R-M7 i R-M10) i veoma su uključeni u povećanje bolesti. Ove zajedničke modularne karakteristike između dva skupa podataka dodatno podržavaju obogaćivanje ćelijskog tipa i promjene povezane s bolestima koje smo primijetili u proteomu mozga. Međutim, uočili smo mnoge značajne razlike između nivoa RNK i proteina pojedinačnih markera u ovim zajedničkim modulima. Korelaciona analiza diferencijalne ekspresije proteomike i transkriptomike molekula unutar ovih preklapajućih modula (Slika 3D) naglašava ovu nedoslednost. Na primjer, APP i nekoliko drugih proteina glijalnog modula (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 i SFRP1) pokazali su značajno povećanje AD proteoma, ali nije bilo gotovo nikakve promjene u AD transkriptomu. Ove promene specifične za protein mogu biti usko povezane sa amiloidnim plakovima (23, 35), ističući proteom kao izvor patoloških promena, a ove promene se možda neće odraziti na transkriptom.
Nakon neovisne analize mozga i CSF proteoma koje smo otkrili, izvršili smo sveobuhvatnu analizu dva skupa podataka kako bismo identificirali biomarkere AD CSF koji se odnose na patofiziologiju moždane mreže. Prvo moramo definirati preklapanje dva proteoma. Iako je široko prihvaćeno da CSF odražava neurohemijske promjene u AD mozgu (4), tačan stepen preklapanja između AD mozga i CSF proteoma je nejasan. Upoređujući broj zajedničkih genskih proizvoda otkrivenih u naša dva proteoma, otkrili smo da je skoro 70% (n = 1936) proteina identificiranih u cerebrospinalnoj tekućini također kvantificirano u mozgu (slika 4A). Većina ovih preklapajućih proteina (n = 1721) mapirana je u jedan od 44 modula koekspresije iz skupa podataka otkrića mozga (slika 4B). Kao što se očekivalo, šest najvećih moždanih modula (M1 do M6) pokazalo je najveću količinu CSF preklapanja. Međutim, postoje manji moždani moduli (na primjer, M15 i M29) koji postižu neočekivano visok stupanj preklapanja, veći od modula mozga koji je dvostruko veći od njegove veličine. To nas motivira da usvojimo detaljniju, statistički vođenu metodu za izračunavanje preklapanja između mozga i cerebrospinalne tekućine.
(A i B) Proteini otkriveni u mozgu otkrića i skupovima podataka CSF se preklapaju. Većina ovih preklapajućih proteina povezana je sa jednim od 44 koekspresiona modula mreže koekspresije mozga. (C) Otkrijte preklapanje između proteoma cerebrospinalne tekućine i proteoma moždane mreže. Svaki red toplotne karte predstavlja zasebnu analizu preklapanja hipergeometrijskog FET-a. Gornji red prikazuje preklapanje (sivo/crno sjenčanje) između moždanog modula i cijelog CSF proteoma. Drugi red prikazuje da je preklapanje između moždanih modula i CSF proteina (osenčeno crvenom bojom) značajno povećano u AD (P <0,05). Treći red pokazuje da je preklapanje između moždanih modula i CSF proteina (plavo sjenčanje) značajno smanjeno u AD (P <0,05). Koristite BH metodu da ispravite P vrijednost izvedenu iz FET-a. (D) Sklopivi modul modula zasnovan na asocijaciji tipa ćelije i povezanim GO terminima. Ovi paneli sadrže ukupno 271 protein povezan sa mozgom, koji imaju značajnu diferencijalnu ekspresiju u proteomu CSF.
Koristeći jednostrane FET-ove, procijenili smo važnost preklapanja proteina između CSF proteoma i pojedinačnih moždanih modula. Analiza je otkrila da ukupno 14 moždanih modula u skupu podataka CSF ima statistički značajna preklapanja (FDR prilagođen P <0,05) i dodatni modul (M18) čije je preklapanje blizu značajnosti (FDR prilagođen P = 0,06) (Slika 4C , gornji red). Također nas zanimaju moduli koji se snažno preklapaju s različito eksprimiranim proteinima CSF. Stoga smo primijenili dvije dodatne FET analize da odredimo koji od (i) proteina CSF je značajno povećan u AD i (ii) CSF protein je značajno smanjen u AD (P <0,05, upareni t test AD/kontrola) Moduli mozga sa značajnim preklapanjem između njih. Kao što je prikazano u srednjim i donjim redovima slike 4C, ove dodatne analize pokazuju da se 8 od 44 moždana modula značajno preklapaju s proteinom koji je dodan u AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 i M38) . ), dok su samo dva modula (M6 i M15) pokazala značajno preklapanje sa smanjenim proteinom u AD CSF. Kao što se i očekivalo, svih 10 modula je u 15 modula s najvećim preklapanjem sa CSF proteomom. Stoga pretpostavljamo da su ovih 15 modula izvori visokog prinosa biomarkera likvora iz mozga iz AD.
Sastavili smo ovih 15 preklapajućih modula u pet velikih proteinskih panela na osnovu njihove blizine u dijagramu stabla WGCNA i njihove povezanosti sa tipovima ćelija i ontologijom gena (slika 4D). Prvi panel sadrži module bogate neuronskim markerima i proteinima povezanim sa sinapsama (M1 i M12). Sinaptički panel sadrži ukupno 94 proteina, a nivoi u proteomu likvora su se značajno promijenili, što ga čini najvećim izvorom CSF markera povezanih s mozgom među pet panela. Druga grupa (M6 i M15) pokazala je blisku povezanost sa markerima endotelnih ćelija i vaskularnim tijelom, kao što su „zacjeljivanje rana” (M6) i „regulacija humoralnog imunološkog odgovora” (M15). M15 je također visoko povezan s metabolizmom lipoproteina, koji je usko povezan s endotelom (36). Vaskularni panel sadrži 34 CSF markera koji se odnose na mozak. Treća grupa uključuje module (M2 i M4) koji su značajno povezani sa markerima oligodendrocita i proliferacijom ćelija. Na primjer, termini ontologije najvišeg nivoa M2 uključuju “pozitivnu regulaciju replikacije DNK” i “proces biosinteze purina”. U međuvremenu, oni kod M4 uključuju "diferencijaciju glijalnih ćelija" i "segregaciju hromozoma". Panel za mijelinizaciju sadrži 49 CSF markera koji se odnose na mozak.
Četvrta grupa sadrži najviše modula (M30, M29, M18, M24 i M5), a gotovo svi moduli su značajno bogati mikroglijama i markerima astrocita. Slično panelu za mijelinizaciju, četvrti panel takođe sadrži module (M30, M29 i M18) koji su usko povezani sa proliferacijom ćelija. Ostali moduli u ovoj grupi su veoma povezani sa imunološkim terminima, kao što su „proces imunološkog efekta” (M5) i „regulacija imunološkog odgovora” (M24). Glijalna imunološka grupa sadrži 42 CSF markera vezana za mozak. Konačno, posljednji panel uključuje 52 markera vezana za mozak na četiri modula (M44, M3, M33 i M38), a svi su na tijelu povezani sa skladištenjem energije i metabolizmom. Najveći od ovih modula (M3) usko je povezan s mitohondrijama i bogat je markerima specifičnim za neurone. M38 je jedan od manjih članova modula u ovom metabolomu i također pokazuje umjerenu neuronsku specifičnost.
Sve u svemu, ovih pet panela odražavaju širok spektar tipova ćelija i funkcija u AD korteksu i zajedno sadrže 271 CSF marker koji se odnosi na mozak (tabela S2G). Kako bismo procijenili valjanost ovih MS rezultata, koristili smo test proširenja blizine (PEA), ortogonalnu tehnologiju zasnovanu na antitijelima sa mogućnošću multipleksiranja, visokom osjetljivošću i specifičnošću, te smo ponovo analizirali uzorke cerebrospinalne tekućine za koje smo pronašli podskup od ovih 271 biomarkera (n = 36). Ovih 36 ciljeva pokazuju promjenu AD višekratnika PEA, što je usko povezano s našim nalazima zasnovanim na MS (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), što je snažno potvrdilo rezultate naše sveobuhvatne MS analize (Slika S4 ).
Biološke teme koje naglašavaju naših pet grupa, od sinaptičke signalizacije do energetskog metabolizma, sve su povezane s patogenezom AD (1-3). Stoga je svih 15 modula koji sadrže ove panele povezani s AD patologijom u proteomu mozga koju smo otkrili (slika 2B). Najznačajnija je visoka pozitivna patološka korelacija između naših glijalnih modula i jaka negativna patološka korelacija između naših najvećih neuronskih modula (M1 i M3). Analiza diferencijalne ekspresije našeg repliciranog proteoma mozga (slika S3D) također naglašava glijalne proteine izvedene iz M5 i M18. Kod AsymAD-a i simptomatskog AD, najviše su povećani glijalni proteini i M1-povezane sinapse. Protein je najviše smanjen. Ova zapažanja ukazuju da je 271 marker cerebrospinalne tekućine koje smo identificirali u pet grupa povezan s procesima bolesti u korteksu AD, uključujući i one koji se javljaju u ranim asimptomatskim fazama.
Kako bismo bolje analizirali smjer promjene proteina panela u mozgu i kičmenoj tekućini, nacrtali smo sljedeće za svaki od 15 preklapajućih modula: (i) pronašli nivo izobilja modula u skupu podataka mozga i (ii) modul protein Razlika je izražena u cerebrospinalnoj tečnosti (slika S5). Kao što je ranije spomenuto, WGCNA se koristi za određivanje količine modula ili karakteristične vrijednosti proteina u mozgu (13). Mapa vulkana se koristi za opisivanje diferencijalne ekspresije modularnih proteina u cerebrospinalnoj tekućini (AD/kontrola). Ove brojke pokazuju da tri od pet panela pokazuju različite trendove ekspresije u moždanoj i kičmenoj tekućini. Dva modula sinapsnog panela (M1 i M12) pokazuju smanjenje nivoa obilja u AD mozgu, ali se značajno preklapaju sa povećanim proteinom u AD CSF (slika S5A). Moduli vezani za neurone koji sadrže metabolom (M3 i M38) pokazali su nedosljedne slične obrasce ekspresije mozga i cerebrospinalne tekućine (slika S5E). Vaskularni panel je također pokazao različite trendove ekspresije, iako su njegovi moduli (M6 i M15) umjereno povećani u AD mozgu i smanjeni u bolesnoj CSF (slika S5B). Preostala dva panela sadrže velike glijalne mreže čiji su proteini dosljedno regulirani naviše u oba odjeljka (Slika S5, C i D).
Imajte na umu da ovi trendovi nisu zajednički za sve markere na ovim panelima. Na primjer, sinaptički panel uključuje nekoliko proteina koji su značajno smanjeni u AD mozgu i CSF (slika S5A). Među ovim naniže regulisanim markerima cerebrospinalne tečnosti su NPTX2 i VGF od M1, i hromogranin B od M12. Međutim, uprkos ovim izuzecima, većina naših sinaptičkih markera je povišena u AD spinalnoj tečnosti. Sve u svemu, ove analize su mogle razlikovati statistički značajne trendove u nivou mozga i cerebrospinalne tekućine u svakom od naših pet panela. Ovi trendovi naglašavaju složen i često različit odnos između ekspresije proteina mozga i CSF-a u AD.
Zatim smo koristili analizu MS replikacije visoke propusnosti (CSF replikacija 1) kako bismo suzili naš 271 skup biomarkera na najperspektivnije i reproduktivne ciljeve (Slika 5A). CSF kopija 1 sadrži ukupno 96 uzoraka iz Emory Goizueta ADRC, uključujući kontrolu, AsymAD i AD kohortu (Tabela S1A). Ove slučajeve AD karakteriše blagi kognitivni pad (srednja vrednost MoCA, 20,0 ± 3,8) i promene u biomarkerima AD potvrđene u cerebrospinalnoj tečnosti (Tabela S1A). Za razliku od analize CSF-a koju smo otkrili, ova replikacija se izvodi korištenjem efikasnije i učinkovitije MS metode “single-shot” (bez off-line frakcioniranja), uključujući pojednostavljeni protokol pripreme uzorka koji eliminira potrebu za imunodeplecijom pojedinačnih uzoraka . Umjesto toga, koristi se jedan “kanal za poboljšanje” osiromašenog imuniteta za pojačavanje signala manje zastupljenih proteina (37). Iako smanjuje ukupnu pokrivenost proteomom, ova metoda s jednim udarcem značajno smanjuje vrijeme rada mašine i povećava broj TMT-obilježenih uzoraka koji se mogu analizirati kao održivi (17, 38). Ukupno, analizom je identifikovano 6.487 peptida, koji su mapirani na 1.183 proteoma u 96 slučajeva. Kao i kod analize likvora koju smo otkrili, samo oni proteini kvantificirani u najmanje 50% uzoraka uključeni su u naknadne proračune, a podaci su regresirani za efekte starosti i spola. To je dovelo do konačne kvantifikacije 792 proteoma, od kojih je 95% također identificirano u pronađenom skupu podataka CSF.
(A) Ciljevi proteina CSF vezani za mozak verifikovani u prvoj repliciranoj kohorti CSF i uključeni u završni panel (n = 60). (B do E) Nivoi biomarkera panela (kompozitni z-rezultati) izmjereni u četiri kohorte replikacije CSF. Upareni t-testovi ili ANOVA sa Tukeyjevom naknadnom korekcijom korišteni su za procjenu statističke značajnosti promjena u obilju u svakoj ponovljenoj analizi. CT, kontrola.
Budući da smo posebno zainteresirani za provjeru našeg 271 cilja CSF-a koji se odnosi na mozak kroz sveobuhvatnu analizu, ograničit ćemo dalje ispitivanje ovog repliciranog proteoma na ove markere. Među ovim 271 proteinom, 100 je otkriveno u CSF replikaciji 1. Slika S6A prikazuje diferencijalnu ekspresiju ovih 100 preklapajućih markera između kontrolnih i AD uzoraka replikacije. Sinaptički i metabolički histoni se najviše povećavaju u AD, dok se vaskularni proteini najviše smanjuju u bolesti. Većina od 100 preklapajućih markera (n = 70) zadržala je isti smjer promjene u dva skupa podataka (slika S6B). Ovih 70 validiranih CSF markera povezanih s mozgom (Tabela S2H) u velikoj mjeri odražavaju prethodno uočene trendove ekspresije panela, odnosno smanjenje vaskularnih proteina i povećanje regulacije svih ostalih panela. Samo 10 od ovih 70 validiranih proteina pokazalo je promjene u obilju AD koje su bile u suprotnosti sa ovim panel trendovima. Kako bismo stvorili panel koji najbolje odražava ukupni trend mozga i cerebrospinalne tekućine, isključili smo ovih 10 proteina iz panela od interesa koji smo konačno potvrdili (Slika 5A). Stoga, naš panel na kraju uključuje ukupno 60 proteina verificiranih u dvije nezavisne CSF AD kohorte koristeći različite pripreme uzoraka i analizu MS platforme. Grafičke ekspresije z-skora ovih završnih panela u kontrolnoj kopiji 1 CSF i slučajevima AD potvrdile su trend panela uočen u kohorti CSF koju smo pronašli (Slika 5B).
Među ovih 60 proteina, postoje molekule za koje se zna da su povezane sa AD, kao što je osteopontin (SPP1), koji je proinflamatorni citokin koji je povezan sa AD u mnogim studijama (39-41), i GAP43, sinaptički protein što je jasno povezano sa neurodegeneracijom (42). Najpotpunije verifikovani proteini su markeri koji se odnose na druge neurodegenerativne bolesti, kao što su amiotrofična lateralna skleroza (ALS) povezana superoksid dismutaza 1 (SOD1) i desaharaza povezana sa Parkinsonovom bolešću (PARK7). Također smo potvrdili da mnogi drugi markeri, kao što su SMOC1 i signalni protein 1 vezanja za membranu bogatog mozga (BASP1), imaju ograničene prethodne veze s neurodegeneracijom. Vrijedi napomenuti da nam je zbog njihove niske ukupne zastupljenosti u proteomu CSF-a teško koristiti ovu visokopropusnu metodu detekcije pojedinačnih snimaka kako bismo pouzdano otkrili MAPT i određene druge proteine povezane s AD (na primjer, NEFL i NRGN ) ( 43, 44).
Zatim smo provjerili ovih 60 prioritetnih markera panela u tri dodatne analize. U kopiji CSF 2, koristili smo jedan TMT-MS za analizu nezavisne grupe od 297 kontrolnih i AD uzoraka iz Emory Goizueta ADRC (17). CSF replikacija 3 uključivala je ponovnu analizu dostupnih TMT-MS podataka od 120 kontrolnih pacijenata i pacijenata sa AD iz Lozane, Švajcarska (45). Otkrili smo više od dvije trećine od 60 markera prioriteta u svakom skupu podataka. Iako je švicarska studija koristila različite MS platforme i metode kvantifikacije TMT (45, 46), mi smo snažno reproducirali trendove panela u dvije ponovljene analize (Slika 5, C i D, te tabele S2, I i J). Da bismo procijenili specifičnost bolesti naše grupe, koristili smo TMT-MS za analizu četvrtog skupa podataka o replikaciji (CSF replikacija 4), koji je uključivao ne samo kontrolne (n = 18) i AD (n = 17) slučajeve, već i PD ( n = 14)), ALS (n = 18) i uzorci frontotemporalne demencije (FTD) (n = 11) (Tabela S1A). Uspješno smo kvantificirali gotovo dvije trećine panelnih proteina u ovoj kohorti (38 od 60). Ovi rezultati ističu promjene specifične za AD u svih pet panela biomarkera (slika 5E i tabela S2K). Povećanje grupe metabolita pokazalo je najjaču AD specifičnost, praćeno mijelinizacijom i glijalnom grupom. U manjoj mjeri, FTD također pokazuje povećanje između ovih panela, što može odražavati slične potencijalne promjene mreže (17). Nasuprot tome, ALS i PD su pokazali gotovo iste profile mijelinizacije, glija i metaboloma kao i kontrolna grupa. Sve u svemu, uprkos razlikama u pripremi uzoraka, MS platformi i metodama kvantifikacije TMT, ove ponovljene analize pokazuju da naši prioritetni panel markeri imaju vrlo konzistentne promjene specifične za AD u više od 500 jedinstvenih CSF uzoraka.
Neurodegeneracija AD je široko prepoznata nekoliko godina prije pojave kognitivnih simptoma, tako da postoji hitna potreba za biomarkerima AsymAD-a (5, 31). Međutim, sve više i više dokaza pokazuje da je biologija AsymAD-a daleko od homogene, a složena interakcija rizika i otpornosti dovodi do velikih individualnih razlika u kasnijoj progresiji bolesti (47). Iako se koriste za identifikaciju slučajeva AsymAD-a, nivoi ključnih biomarkera CSF (Aβ1-42, ukupni tau i p-tau) nisu dokazali da mogu pouzdano predvidjeti ko će napredovati do demencije (4, 7), što ukazuje na više. neophodno je uključiti holističke alate za biomarkere zasnovane na višestrukim aspektima fiziologije mozga kako bi se precizno stratificirao rizik ove populacije. Stoga smo naknadno analizirali naš AD validirani panel biomarkera u AsymAD populaciji kopije 1 CSF-a. Ovih 31 slučaj AsymAD-a pokazao je abnormalne nivoe biomarkera (Aβ1–42/ukupni tau ELISA omjer, <5,5) i potpunu spoznaju (srednja MoCA, 27,1 ± 2.2) (Tabela S1A). Osim toga, sve osobe s AsymAD-om imaju skor kliničke demencije 0, što ukazuje da nema dokaza o padu dnevnih kognitivnih ili funkcionalnih performansi.
Prvo smo analizirali nivoe validiranih panela u svih 96 CSF replika 1, uključujući AsymAD kohortu. Otkrili smo da je nekoliko panela u AsymAD grupi imalo značajne promjene u obilju poput AD, vaskularni panel je pokazao opadajući trend u AsymAD-u, dok su svi ostali paneli pokazali uzlazni trend (Slika 6A). Stoga su svi paneli pokazali visoko značajnu korelaciju sa ELISA Aβ1-42 i ukupnim tau nivoima (Slika 6B). Nasuprot tome, korelacija između grupe i MoCA rezultata je relativno loša. Jedan od najupečatljivijih nalaza iz ovih analiza je veliki raspon zastupljenosti panela u AsymAD kohorti. Kao što je prikazano na slici 6A, nivo panela AsymAD grupe obično prelazi nivo panela kontrolne grupe i AD grupe, pokazujući relativno veliku varijabilnost. Da bismo dalje istražili ovu heterogenost AsymAD-a, primijenili smo analizu multidimenzionalnog skaliranja (MDS) na 96 slučajeva replikacije CSF 1. MDS analiza omogućava vizualizaciju sličnosti između slučajeva na osnovu određenih varijabli u skupu podataka. Za ovu klaster analizu koristimo samo one validirane panel markere koji imaju statistički značajnu promjenu (P <0,05, AD/kontrola) na nivou otkrivanja i replikacije 1 proteoma CSF (n = 29) (Tabela S2L). Ova analiza je proizvela jasno prostorno grupisanje između naših kontrolnih i AD slučajeva (slika 6C). Nasuprot tome, neki AsymAD slučajevi su jasno grupirani u kontrolnoj grupi, dok su drugi locirani u slučajevima AD. Da bismo dalje istražili ovu AsymAD heterogenost, koristili smo našu MDS mapu da definišemo dve grupe ovih AsymAD slučajeva. Prva grupa je uključivala slučajeve AsymAD grupisane bliže kontroli (n = 19), dok su drugu grupu karakterisali slučajevi AsymAD sa profilom markera bližim AD (n = 12).
(A) Nivo ekspresije (z-score) grupe biomarkera CSF u svih 96 uzoraka u kohorti replikacije CSF 1, uključujući AsymAD. Analiza varijanse s Tukeyjevom naknadnom korekcijom korištena je za procjenu statističke značajnosti promjena u obilju panela. (B) Analiza korelacije nivoa rasprostranjenosti proteina na panelu (z-skora) sa MoCA skorom i ukupnim tau nivoom u uzorcima ELISA Aβ1-42 i CSF kopija 1. Prikazuje se Pearsonov koeficijent korelacije sa relevantnom P vrijednošću. (C) MDS za 96 slučajeva kopije 1 CSF-a zasnovan je na nivoima rasprostranjenosti 29 validiranih panel markera, koji su značajno promijenjeni u skupovima podataka za otkrivanje i kopiju 1 CSF-a [P <0,05 AD/kontrola (CT)]. Ova analiza je korišćena da se AsymAD grupa podeli na kontrolnu (n = 19) i AD (n = 12) podgrupu. (D) Vulkanski dijagram pokazuje diferencijalnu ekspresiju svih proteina replikacije 1 CSF sa promjenom log2 puta (x-osa) u odnosu na -log10 statističku P vrijednost između dvije AsymAD podgrupe. Biomarkeri na ploči su obojeni. (E) CSF replikacija 1 nivo obilja biomarkera selekcione grupe je različito izražen između AsymAD podgrupa. Tukeyjeva post-prilagođena analiza varijanse korištena je za procjenu statističke značajnosti.
Ispitali smo diferencijalnu ekspresiju proteina između ovih kontrolnih i slučajeva AsymAD sličnih AD (slika 6D i tabela S2L). Rezultirajuća karta vulkana pokazuje da se 14 oznaka na ploči značajno promijenilo između dvije grupe. Većina ovih markera su članovi sinapse i metaboloma. Međutim, SOD1 i miristoilirani supstrat C protein kinaze bogat alaninom (MARCKS), koji su članovi mijelinske i glijalne imunološke grupe, također pripadaju ovoj grupi (Slika 6, D i E). Vaskularni panel je takođe doprineo dva markera koja su značajno smanjena u grupi AsymAD nalik AD, uključujući AE vezujući protein 1 (AEBP1) i člana porodice komplementa C9. Nije bilo značajne razlike između kontrolne i AsymAD podgrupe slične AD u ELISA AB1-42 (P = 0,38) i p-tau (P = 0,28), ali je zaista postojala značajna razlika u ukupnom tau nivou (P = 0,0031 ) (Sl. S7). Postoji nekoliko panel markera koji ukazuju na to da su promjene između dvije AsymAD podgrupe značajnije od ukupnih tau nivoa (na primjer, YWHAZ, SOD1 i MDH1) (slika 6E). Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da naš validirani panel može sadržavati biomarkere koji mogu podtipovati i potencijalnu stratifikaciju rizika pacijenata sa asimptomatskom bolešću.
Postoji hitna potreba za sistemskim biomarkerskim alatima za bolje mjerenje i ciljanje različite patofiziologije iza AD. Očekuje se da će ovi alati ne samo promijeniti naš dijagnostički okvir AD, već i promovirati usvajanje učinkovitih strategija liječenja specifičnih za pacijente (1, 2). U tu svrhu, primijenili smo nepristrani, sveobuhvatni proteomski pristup na AD mozak i CSF kako bismo identificirali web-bazirane biomarkere CSF-a koji odražavaju širok raspon patofiziologije zasnovane na mozgu. Naša analiza proizvela je pet panela biomarkera CSF, koji (i) odražavaju sinapse, krvne sudove, mijelin, imunološku i metaboličku disfunkciju; (ii) pokazati snažnu ponovljivost na različitim MS platformama; (iii) Pokazati progresivne promjene specifične za bolest u ranim i kasnim fazama AD. Sve u svemu, ovi nalazi predstavljaju obećavajući korak ka razvoju raznovrsnih, pouzdanih, web orijentiranih alata za biomarkere za istraživanje AD i kliničke primjene.
Naši rezultati pokazuju visoko očuvanu organizaciju proteoma AD moždane mreže i podržavaju njegovu upotrebu kao sidro za razvoj biomarkera zasnovanog na sistemu. Naša analiza pokazuje da dva nezavisna TMT-MS skupa podataka koji sadrže AD i AsymAD mozgove imaju jaku modularnost. Ovi nalazi proširuju naš prethodni rad, pokazujući očuvanje moćnih modula više od 2000 moždanih tkiva iz više nezavisnih kohorti u frontalnom, parijetalnom i temporalnom korteksu (17). Ova mreža konsenzusa odražava različite promjene povezane sa bolestima uočene u trenutnim istraživanjima, uključujući povećanje inflamatornih modula bogatih glijama i smanjenje modula bogatih neuronima. Kao i trenutna istraživanja, ova velika mreža također ima značajne modularne promjene u AsymAD-u, pokazujući niz različitih pretkliničkih patofiziologija (17).
Međutim, unutar ovog visoko konzervativnog okvira zasnovanog na sistemu, postoji više fino zrnaste biološke heterogenosti, posebno među pojedincima u ranim fazama AD. Naš panel biomarkera je u stanju da prikaže dve podgrupe u AsymAD-u, koje pokazuju značajnu diferencijalnu ekspresiju više CSF markera. Naša grupa je uspela da istakne biološke razlike između ove dve podgrupe, koje nisu bile očigledne na nivou ključnih AD biomarkera. U poređenju sa kontrolnom grupom, odnos Aβ1-42/ukupni tau kod ovih AsymAD pojedinaca je bio abnormalno nizak. Međutim, samo su se ukupni tau nivoi značajno razlikovali između dve AsymAD podgrupe, dok su nivoi Aβ1-42 i p-tau ostali relativno uporedivi. Budući da se čini da je visok CSF tau bolji prediktor kognitivnih simptoma od nivoa Aβ1-42 (7), sumnjamo da dvije AsymAD kohorte mogu imati različite rizike od progresije bolesti. S obzirom na ograničenu veličinu uzorka našeg AsymAD-a i nedostatak longitudinalnih podataka, potrebna su daljnja istraživanja kako bi se sa sigurnošću izvukli ovi zaključci. Međutim, ovi rezultati pokazuju da sistemski baziran CSF panel može poboljšati našu sposobnost da efikasno stratificiramo pojedince tokom asimptomatskog stadijuma bolesti.
Sve u svemu, naši nalazi podržavaju ulogu višestrukih bioloških funkcija u patogenezi AD. Međutim, neregulirani energetski metabolizam postao je istaknuta tema svih naših pet validiranih ploča za označavanje. Metabolički proteini, kao što su hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaza 1 (HPRT1) i laktat dehidrogenaza A (LDHA), najjače su potvrđeni sinaptički biomarkeri, što ukazuje da je povećanje AD CSF visoko reproducibilan pol. Naši krvni sudovi i glijalne ploče takođe sadrže nekoliko markera uključenih u metabolizam oksidativnih supstanci. Ovi nalazi su u skladu s ključnom ulogom koju metabolički procesi igraju u cijelom mozgu, ne samo da bi se zadovoljile visoke energetske potrebe neurona, već i da bi se zadovoljile visoke energetske potrebe astrocita i drugih glijalnih stanica (17, 48). Naši rezultati podržavaju sve veće dokaze da promjene u redoks potencijalu i prekid energetskih puteva mogu biti ključna veza između nekoliko ključnih procesa uključenih u patogenezu AD, uključujući mitohondrijalne poremećaje, upalu posredovanu glijama i vaskularno oštećenje (49). Osim toga, metabolički biomarkeri cerebrospinalne tekućine sadrže veliki broj različito bogatih proteina između naše kontrolne i AsymAD podgrupe slične AD, što sugerira da poremećaj ovih energetskih i redoks puteva može biti kritičan u pretkliničkoj fazi bolesti.
Različiti trendovi panela mozga i cerebrospinalne tekućine koje smo primijetili također imaju zanimljive biološke implikacije. Sinapse i metabolomi bogati neuronima pokazuju smanjene nivoe u AD mozgu i povećanu količinu u cerebrospinalnoj tečnosti. S obzirom na to da su neuroni bogati mitohondrijama koje proizvode energiju u sinapsama koje osiguravaju energiju za svoje brojne specijalizirane signale (50), očekuje se sličnost profila ekspresije ove dvije grupe neurona. Gubitak neurona i ekstruzija oštećenih ćelija mogu objasniti ove trendove u mozgu i likvoru u kasnijim bolestima, ali ne mogu objasniti rane promjene panela koje opažamo (13). Jedno moguće objašnjenje za ove nalaze u ranoj asimptomatskoj bolesti je abnormalno sinaptičko orezivanje. Novi dokazi na mišjim modelima sugeriraju da sinaptička fagocitoza posredovana mikrogijom može biti nenormalno aktivirana u AD i dovesti do ranog gubitka sinapse u mozgu (51). Ovaj odbačeni sinaptički materijal može se akumulirati u likvoru, zbog čega opažamo povećanje likvora u neuronskom panelu. Imunološki posredovano sinaptičko orezivanje također može djelomično objasniti povećanje glijalnih proteina koje opažamo u mozgu i cerebrospinalnoj tekućini tijekom cijelog procesa bolesti. Osim sinaptičkog orezivanja, ukupne abnormalnosti u egzocitnom putu također mogu dovesti do različitih ekspresija neuronskih markera u mozgu i likvoru. Brojna istraživanja su pokazala da se sadržaj egzosoma u patogenezi AD mozga promijenio (52). Ekstracelularni put je takođe uključen u proliferaciju Aβ (53, 54). Vrijedi napomenuti da supresija egzosomalne sekrecije može smanjiti patologiju sličnu AD kod transgenih mišjih modela AD (55).
U isto vrijeme, protein u vaskularnom panelu pokazao je umjereno povećanje AD mozga, ali značajno smanjenje u CSF. Disfunkcija krvno-moždane barijere (BBB) može djelomično objasniti ove nalaze. Mnoge nezavisne postmortalne studije na ljudima su pokazale raspad BBB u AD (56, 57). Ove studije su potvrdile različite abnormalne aktivnosti oko ovog čvrsto zatvorenog sloja endotelnih ćelija, uključujući curenje moždanih kapilara i perivaskularno nakupljanje proteina koji se prenose krvlju (57). Ovo može pružiti jednostavno objašnjenje za povišene vaskularne proteine u mozgu, ali ne može u potpunosti objasniti iscrpljivanje tih istih proteina u cerebrospinalnoj tekućini. Jedna od mogućnosti je da centralni nervni sistem aktivno izoluje ove molekule kako bi riješio problem povećane upale i oksidativnog stresa. Smanjenje nekih od najtežih CSF proteina u ovom panelu, posebno onih koji su uključeni u regulaciju lipoproteina, povezano je sa inhibicijom štetnih nivoa upale i neuroprotektivnog procesa reaktivnih vrsta kiseonika. Ovo važi za paroksonazu 1 (PON1), enzim koji vezuje lipoproteine odgovoran za smanjenje nivoa oksidativnog stresa u cirkulaciji (58, 59). Prekursor alfa-1-mikroglobulina/bikunina (AMBP) je još jedan značajno smanjeni marker vaskularne grupe. To je prekursor lipidnog transportera bikunina, koji je također uključen u supresiju upale i neurološku zaštitu (60, 61).
Uprkos raznim zanimljivim hipotezama, nemogućnost direktnog otkrivanja mehanizama biohemijskih bolesti je dobro poznato ograničenje proteomičke analize vođene otkrićem. Stoga su neophodna dalja istraživanja kako bi se pouzdano definirali mehanizmi iza ovih panela biomarkera. Kako bi se krenulo ka razvoju kliničke analize zasnovane na MS, budući smjer također zahtijeva upotrebu ciljanih kvantitativnih metoda za verifikaciju biomarkera velikih razmjera, kao što je selektivno ili paralelno praćenje reakcija (62). Nedavno smo koristili paralelno praćenje reakcija (63) da bismo potvrdili mnoge od ovdje opisanih promjena proteina CSF. Nekoliko prioritetnih ciljeva panela je kvantificirano sa značajnom preciznošću, uključujući YWHAZ, ALDOA i SMOC1, koji se mapiraju na naše sinapse, metabolizam i inflamaciju, respektivno (63). Nezavisna akvizicija podataka (DIA) i druge strategije zasnovane na MS također mogu biti korisne za verifikaciju cilja. Bud et al. (64) Nedavno je pokazano da postoji značajno preklapanje između AD biomarkera identifikovanih u našem skupu podataka o otkrivanju CSF i nezavisnog DIA-MS skupa podataka, koji se sastoji od skoro 200 uzoraka CSF iz tri različite evropske kohorte. Ove nedavne studije podržavaju potencijal naših panela da se transformišu u pouzdanu detekciju zasnovanu na MS. Tradicionalna detekcija bazirana na antitijelima i aptamerima je također važna za dalji razvoj ključnih AD biomarkera. Zbog male količine CSF-a, teže je otkriti ove biomarkere korištenjem visokopropusnih MS metoda. NEFL i NRGN su dva takva primjera biomarkera likvora s malom zastupljenošću, koji su mapirani na panel u našoj sveobuhvatnoj analizi, ali se ne mogu pouzdano otkriti korištenjem naše jedinstvene MS strategije. Strategije ciljanja zasnovane na višestrukim antitijelima, kao što je PEA, mogu promovirati kliničku transformaciju ovih markera.
Sve u svemu, ova studija pruža jedinstven proteomski pristup za identifikaciju i verifikaciju biomarkera AD CSF zasnovan na različitim sistemima. Optimizacija ovih markerskih panela u dodatnim AD kohortama i MS platformama može se pokazati obećavajućim za unapređenje stratifikacije i liječenja AD rizika. Studije koje procjenjuju longitudinalni nivo ovih panela tokom vremena su također kritične za određivanje koja kombinacija markera najbolje stratificira rizik od rane bolesti i promjene u ozbiljnosti bolesti.
Osim 3 uzorka koje je kopirao CSF, svi uzorci CSF korišćeni u ovoj studiji prikupljeni su pod pokroviteljstvom Emory ADRC ili blisko povezanih istraživačkih institucija. U ovim proteomskim studijama korišteno je ukupno četiri seta Emory CSF uzoraka. Utvrđeno je da kohorta CSF sadrži uzorke od 20 zdravih kontrola i 20 pacijenata sa AD. CSF kopija 1 uključuje uzorke od 32 zdrave kontrole, 31 AsymAD pojedinca i 33 AD osobe. CSF kopija 2 sadrži 147 kontrola i 150 AD uzoraka. Kohorta 4 replikacije CSF sa više bolesti uključivala je 18 kontrola, 17 AD, 19 ALS, 13 PD i 11 uzoraka FTD. Prema sporazumu koji je odobrio Odbor za institucionalnu reviziju Univerziteta Emory, svi učesnici Emory studije dobili su informirani pristanak. Prema Smjernicama najbolje prakse Nacionalnog instituta za starenje za centre za Alchajmerovu bolest iz 2014. (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), cerebrospinalna tekućina je sakupljena i pohranjena lumbalnom punkcijom. Kontrolni i AsymAD i AD pacijenti dobili su standardiziranu kognitivnu procjenu na Emory Cognitive Neurology Clinic ili Goizueta ADRC. Njihove uzorke likvora testirao je INNO-BIA AlzBio3 Luminex za ELISA Aβ1-42, ukupnu tau i p-tau analizu (65). ELISA vrijednosti se koriste da podrže dijagnostičku klasifikaciju subjekata na osnovu utvrđenih kriterijuma isključenja biomarkera AD (66, 67). Osnovni demografski i dijagnostički podaci za druge dijagnoze likvora (FTD, ALS i PD) takođe se dobijaju od Emory ADRC ili pridruženih istraživačkih institucija. Sažeti metapodaci slučaja za ove Emory CSF slučajeve mogu se naći u Tabeli S1A. Karakteristike kohorte Swiss CSF replikacije 3 su ranije objavljene (45).
CSF je pronašao uzorak. Kako bi se povećala dubina našeg otkrića skupa podataka o CSF-u, imunološka potrošnja proteina velike količine provedena je prije tripsinizacije. Ukratko, 130 μl CSF iz 40 pojedinačnih uzoraka CSF i jednak volumen (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) stavljeni su u centrifugiranu kolonu (Thermo Fisher Scientific, A89868) u prostoriji temperatura Inkubirajte). Nakon centrifugiranja u trajanju od 15 minuta, centrifugirajte uzorak na 1000 g 2 minute. 3K ultracentrifugalni filter uređaj (Millipore, UFC500396) korišten je za koncentriranje uzorka efluenta centrifugiranjem na 14.000 g tokom 30 minuta. Razblažite sve zapremine uzorka na 75 μl sa fosfatnim puferom. Koncentracija proteina je procijenjena metodom bicinhoninske kiseline (BCA) prema protokolu proizvođača (Thermo Fisher Scientific). Imuno osiromašena CSF (60 μl) iz svih 40 uzoraka je digestirana lizil endopeptidazom (LysC) i tripsinom. Ukratko, uzorak je reduciran i alkiliran sa 1,2 μl 0,5 M tris-2(-karboksietil)-fosfina i 3 μl 0,8 M hloroacetamida na 90°C tokom 10 minuta, a zatim ultrazvukom u vodenom kupatilu 15 minuta. Uzorak je razrijeđen sa 193 μl 8 M urea pufera [8 M urea i 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] do konačne koncentracije od 6 M uree. LysC (4,5 μg; Wako) se koristi za varenje preko noći na sobnoj temperaturi. Uzorak je zatim razrijeđen do 1 M uree sa 50 mM amonijum bikarbonata (ABC) (68). Dodajte jednaku količinu (4,5 μg) tripsina (Promega), a zatim inkubirajte uzorak 12 sati. Zakiseli digestiranu otopinu peptida do konačne koncentracije od 1% mravlje kiseline (FA) i 0,1% trifluorosirćetne kiseline (TFA) (66), a zatim odsolite sa 50 mg Sep-Pak C18 kolone (Vode) kao što je gore opisano (25) . Peptid je zatim eluiran u 1 ml 50% acetonitrila (ACN). Za standardizaciju kvantifikacije proteina u serijama (25), alikvoti od 100 μl iz svih 40 CSF uzoraka su kombinovani kako bi se dobio mješoviti uzorak, koji je zatim podijeljen u pet uzoraka globalnog internog standarda (GIS) (48). Svi pojedinačni uzorci i kombinovani standardi suše se pomoću vakuuma velike brzine (Labconco).
CSF kopira uzorak. Dayon i kolege su ranije opisali osiromašenje imuniteta i probavu uzoraka kopije 3 CSF (45, 46). Preostali replicirani uzorci nisu bili individualno osiromašeni. Probavite ove neuklonjene uzorke u tripsinu kao što je prethodno opisano (17). Za svaku ponovljenu analizu, alikvoti od 120 μl eluiranog peptida iz svakog uzorka su spojeni i podijeljeni u alikvote jednake zapremine koji će se koristiti kao globalni interni standard označen TMT (48). Svi pojedinačni uzorci i kombinovani standardi suše se pomoću vakuuma velike brzine (Labconco). Kako bi se pojačao signal proteina CSF niske rasprostranjenosti, kombinovanjem 125 μl iz svakog uzorka, pripremljen je "poboljšani" uzorak za svaku ponovljene analize [tj., biološki uzorak koji oponaša istraživački uzorak, ali dostupna količina je mnogo veći (37, 69)] spojen u mešoviti uzorak likvora (17). Pomiješani uzorak je zatim imunoreklonjen korištenjem 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), digestiran kao što je gore opisano i uključen u naknadno višestruko označavanje TMT.
Vrijeme objave: 27.08.2021